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1、乙型肝炎病毒cccDNA 检测方法与应用价值 1 一 几个相关问题简介 2 什么是HBVcccDNA 即共价闭合环状DNA covalentlyclosedcircularDNA 乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态 病毒松弛环状DNA rcDNA 进入细胞核 利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等 修复 形成的 结构完整的 超螺旋双链DNA分子 3 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 4 乙型肝炎病毒的复制过程 5 我们为什么要关注HBVcccDNA cccDNA存在于细胞核内 成为乙肝病毒的复制 池 目前尚没有可以进入细胞核内 并能够清除cccDNA的药物 这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和
2、治疗后容易复发的原因之一 肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA 成为肝脏移植术后乙肝复发的来源 还没有稳定 可靠 敏感的cccDNA检测试剂盒问世 6 为什么没有cccDNA检测试剂盒问世 研究和开发该检测技术的时间不长 检测技术上的难度较大 前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模 不能满足临床检验的需求 现有技术灵敏度不高 检测低限104copy ml左右 分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足 存在缺陷 7 多种同源的乙肝病毒DNA分子并存 cccDNA rcDNA ssDNA 整合的HBVDNA 必须有效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA 如何进一步解决特异性的问题 如何解
3、决灵敏度不高的问题 细胞内cccDNA含量的较低 血清中含量 如何简化检测步骤 建立cccDNA检测技术必须克服的难点 8 分离cccDNA和rcDNA的分子基础 分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异 9 二 HBVcccDNA检测技术 10 1 选择性PCR 普通PCR 套式PCR 荧光PCR 2 侵入者探针法 Invaderassaay 3 嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 11 现有的几种cccDNA检测技术简介 选择性PCR 普通PCR 套式PCR 荧光PCR 2 侵入者探针法 Invaderassaay 3 嵌合引物荧光PCR法 12 设计一对
4、特殊引物 跨双缺口引物正义引物P1 与负链互补结合 位于正链缺口上游反义引物P2 与正链互补结合 位于负链缺口下游目的 rcDNA不被扩增 1 选择性PCR 13 选择性PCR rcDNA不被扩增 14 选择性PCR cccDNA能被扩增 15 PCR产物自身退火 selfannealing 选择性 PCR 并非万无一失 16 rcDNA被大量扩增 阳性结果不可靠 定量结果也不可靠HepatologyResearch2003 15 234 243 PBMC WorldJGastroenterol2004 10 1 82 85 血清 Kock等 反应管中rcDNA含量不能超过105copyHep
5、atology1996 23 405 413 血清HBVrcDNA超过108copy ml 进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性 选择性 PCR 并非万无一失 17 与定性法比较增加了一个荧光探针 探针位于扩增片段区 负链缺口下游 与cccDNA的负链互补 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 18 rcDNA不能被扩增无荧光信号 EcoRI 5 P1 P2 3200 1 5 3 1590 3 1820 P1 1820 1590 3200 1 EcoRI P2 cccDNA能被扩增检测到荧光信号 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 19 实时荧光定量PCR的原理 20 实时荧光定量
6、PCR的原理 21 实时荧光定量PCR的原理 22 标准曲线方程YCt 42 0827 3 5554logXcopy相关指数 R2 0 995灵敏度至少可以达到103copy ml 结果 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 23 同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题 由于灵敏度较普通PCR高 假阳性率比普通PCR更高 缺陷 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 24 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 25 解决方案 特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasm
7、id safeDNA酶 选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 26 1 选择性PCR 普通PCR 套式PCR 荧光PCR 侵入者探针法 Invaderassaay 3 嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 27 2 侵入者探针法 Invaderassay 两个体系 两种特殊的探针 invaderprobe和primaryprobe 后者含与待测模板无关的5 侧翼的碱基片段 荧光共振能量转移系统 被核酸内切酶 cleavase 裂解酶 特异地切割5 侧翼碱基片段作为第二个invader 与荧光共振能量转移盒 FRETC 结合 裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂 发出
8、荧光信号 特点 一个模板可以重复使用 每 结合 裂解 结合 裂解 一次为一个循环 每循环一次产生一个荧光信号 呈线性信号放大 28 29 30 侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点 优点 线性信号放大 特异性比荧光PCR法强缺点 灵敏度低 104copy ml 31 1 选择性PCR 普通PCR 套式PCR 荧光PCR 2 侵入者分析法 Invaderassaay 嵌合引物荧光PCR法 现有的几种cccDNA检测技术简介 32 3 嵌合引物荧光PCR法 Shao etal JVirolMethods2003 112 45 52 N 与HBVDNA非同源片段 rcDNA cccDNA 33
9、3 嵌合引物荧光PCR法 34 嵌合引物荧光PCR的优缺点 优点 克服了荧光PCR法的部分缺陷 灵敏度比侵入法提高缺点 仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增 35 无论是选择性荧光PCR 还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR 本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题 必须结合抽提分离 酶切纯化等步骤 以提高特异性 36 三 影响cccDNA池的因素 37 1 cccDNA池的自身恒定 cccDNA池 感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定 5 50copy cell 病毒自身调节 关于病毒的进化关于病毒的 思维 病毒自身的调节 外来压力
10、打破病毒含量自身恒定的结果 38 2 抗病毒药物对cccDNA的影响 现有抗病毒药物 包括干扰素和各种核苷类似物 可以一过性地减少cccDNA 但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性 决定了长疗程抗病毒治疗的必要性 39 3 肝外组织也是cccDNA的储存池 肝外组织细胞中HBV标志的存在情况 肾 胰腺 肺 心肌 心包膜 胃肠黏膜 皮肤 睾丸 前列腺 唾液腺等组织或细胞中均检测到HBV的标志物 HBV吸附 暂居 建立感染状态 依据 从上述组织细胞中检测到cccDNA 但必须解决检测技术问题 40 2 关于血清中是否存在cccDNA的问题 血清中rcDNA含量越高 cccD
11、NA阳性率越高和含量越高 的现象 使我们对方法学提出质疑 肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放cccDNA入血 细胞坏死后 cccDNA释放入血是必然的 但是 裸露的核酸分子在血清中存在多少时间 41 Thankyou 42 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 43 主要经营 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 44 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 45 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojec
12、tororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 46 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 47 主要经营 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 48 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 49 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 50
