第六章--蛋白质定量和定性分析

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1、第六章蛋白质定量和定性分析 Qualitativeandquantitativeanalysisofprotein 第一节蛋白质含量测定第二节蛋白质分子量的测定第三节蛋白质纯度分析第四节糖蛋白中糖含量分析第五节蛋白质序列分析第六节生物质谱技术与蛋白质鉴定 本章内容 第一节蛋白质含量测定 微量凯氏定氮法Folin 酚试剂法紫外光吸收法考马斯亮蓝法 目前常用的有四种古老的经典方法 定氮法 双缩脲法 Biuret法 Folin 酚试剂法 Lowry法 和紫外吸收法 另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法 考马斯亮蓝法 Bradford法 其中Bradford法和Lowry法灵敏度高 比紫外吸收

2、法高10 20倍 比Biuret法高100倍以上 凯氏定氮法比较复杂 但较准确 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质 一 微量凯氏定氮法 蛋白质的主要组成元素C H O N S 各种蛋白质中含氮量恒定在13 19 平均为16 每100克蛋白质中含氮约为16克 而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中 因此测定生物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量 蛋白质含量 含氮量 6 25 蛋白质是含氮的有机化合物 食品与硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 然后碱化蒸馏使氨游离 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定 根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量 一 原

3、理 1 有机物中的氮在强热和CuSO4 浓H2SO4作用下 消化生成 NH4 2SO4 含氮有机物 H2SO4 NH4 SO4 CO2 H2O 2 在凯氏定氮器中与碱作用 通过蒸馏释放出NH3 收集于H3BO3溶液中 NH4 SO4 NaOH Na2SO4 2NH3 H2ONH3 H2O 蒸馏 NH3 H2ONH3 H3BO3 NH4 3BO3 二 实验原理 3 再用已知浓度的HCl标准溶液滴定 根据HCl消耗的量计算出氮的含量 然后乘以相应的换算因子 既得蛋白质的含量 NH4 3BO3 3HCl 3NH4Cl H3BO3 实验试剂与仪器 实验试剂浓硫酸硫酸钾 提高沸点 沸点由330 提高到4

4、00 加速了消化过程 硫酸铜 催化剂 NaOH溶液 30 硼酸溶液 2 盐酸标准溶液 0 01mol L 指示剂 溶于95 乙醇的0 1 溴甲酚绿溶液10ml和溶于95 乙醇的0 1 甲基红2ml混合而成 凯氏定氮装置 自动凯氏定氮仪 三 实验步骤 一 消化称取样品0 5 1g 置于凯氏烧瓶内 不使沾染瓶颈 加入1gK2SO4 0 5gCuSO4及6ml浓H2SO4 在通风橱内的消化炉上加热 先用小火 待水分蒸发完后 可用较大的火焰 消化到瓶内溶液呈透明的蓝绿色为止 但要瓶内无黑点 有则需要瓶内溶液把它冲洗下去 再加热至澄清为止 冷却 转入100ml容量瓶中 以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次 洗液并入

5、容量瓶中 加水至刻度 摇匀 二蒸馏器清洗图中所示的蒸馏器使用方法如下 开放自来水龙头 使水从E进入G 从K流出 水不宜开得过大以免水从G溢出 开放P3使水进入A 从漏斗D中加蒸馏水约10ml入B 用拇指将G管口掀紧 同时开放P1则B中水从Y型管中冲出 随后A中水经K流出 一般情况下 如此重复洗涤两次即可 若蒸馏器内有氨存在 则应加入5ml蒸馏水和30 NaOH溶液2ml后蒸馏一次方可使用 A为蒸气发生器 P3为其进水开关 B为蒸馏室 与出气管M相通 H为装有定量酸液的锥形瓶 B有Y型管 一端与A相通 另一端经P4与漏斗D相连 可经此将样品及试剂加入B F为指形冷凝管 E为进入管 水经F G K

6、而流出 蒸馏时B装进消化好的样品及NaOH 二者反应生产氨 A因加热而产生的水蒸气经Y管进入B 将氨一起带出 经M管进入锥形瓶中被酸吸收 蒸汽经冷凝管F周围被冷却 便于被酸液吸收 三氨的吸收1 蒸馏器洗净后 从G加入小瓷片数粒 开放水龙头和P3使瓷片随水流入A 水放至A球颈处即可 2 取150ml锥形瓶 加入2 硼酸20ml 内加2 3滴混合指示剂 将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层 3 准确吸取稀释消化液5ml 由漏斗D注入蒸馏器 少量蒸馏水冲洗漏斗 加入30 NaOH约5ml 再用少量蒸馏水冲洗 夹紧螺旋夹并水封 使氨气不会从漏斗处流失 4 用电炉加热 待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端

7、滴下时起计时 继续蒸馏5min 然后将锥形瓶放低 使M管离开液面再蒸馏2min 最后用蒸馏水洗导管外壁 取出锥形瓶 随即将蒸馏器洗净 四 滴定 用0 01mol LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止 记录滴定所用HCl的量 五 蛋白质含量的计算试样中蛋白质的含量 V1 V2 HClmol L 0 014 20 6 25 100 WV1 滴定试样时用去的HCl的ml数V2 滴定空白时用去的HCl的ml数mol L HCl的摩尔浓度W 试样的重量0 014 氮的毫摩尔6 25 氮换算成蛋白质的系数20 稀释倍数 四 注意事项 a 样品应是均匀的 若是固体样品应事先研细 液体样要混合均匀 b

8、样品放入凯氏烧瓶时 不要黏附瓶颈上 以免被检样消化不完全 使结果偏低 c 样品中若含脂肪或糖较多 消化过程中易产生大量泡沫 为防止泡沫溢出瓶外 在开始消化时应用小火加热 并时时摇动 d 当样品消化液不易澄清透明时 可将凯氏烧瓶冷却 加入30 过氧化氢2 3mL后再继续加热消化 e 一般消化至透明后 继续消化30min即可 但对于含有特别难以消化的氮化合物的样品 如赖氨酸 组氨酸 色氨酸等时 需适当延长消化时间 有机物如分解完全 消化液呈蓝色或浅绿色 但含铁量多时 呈较深绿色 f 硼酸吸收液的温度不应超过40 否则对氨的吸收作用减弱而造成损失 g 蒸馏完毕后 应先将冷凝管下端提离液面 再蒸2mi

9、n后关掉热源 否则可能造成吸收液倒吸 二 Folin 酚试剂法 一 原理 蛋白质分子的肽键结构在碱性环境中能与Cu2 络合成紫色络合物 双缩脲反应 但络合物颜色浅 吸光度不易测出 故灵敏度低 由于形成络合物后 蛋白质的肽链展开 使其中的酪氨酸等残基充分暴露 而蛋白质中酪氨酸的酚基在碱性条件下与酚试剂 磷钨酸 磷钼酸化合物 反应 使高价的Mo6 和W6 还原生成低价的钼离子和钨离子 呈铜蓝及钨蓝的颜色 蓝色的深浅与蛋白质含量成正比 在一定范围内符合L B定律 20 300 g mL 一 实验原理 Folin 酚试剂由甲试剂与乙试剂组成 甲试剂由碳酸钠 氢氧化钠 硫酸铜及酒石酸钾钠组成 蛋白质中的

10、肽键在碱性条件下 与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用 生成紫红色络合物 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸 硫酸 溴等组成 此试剂在碱性条件下 易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原 呈蓝色反应 钼蓝和钨蓝混合物 其色泽深浅与蛋白质含量成正比 Folin 酚法优点是操作简单 迅速 不需特殊仪器设备 灵敏度高 较紫外吸收法灵敏10 20倍 较双缩脲法灵敏100倍 可测定范围20 250ug蛋白质 反应约在15min内有最大显色 并至少可稳定几小时 此法也适用于测定Tyr Trp含量 其不足之处是此反应受多种因素干扰 二 实验用品 1 材料 待测样品 使用前稀释至合适的倍数2 试剂 标准牛血清 或酪蛋白 溶液 称取125毫克

11、蛋白粉末 用0 1N氢氧化钠溶液润湿 溶解 加蒸馏水到250毫升 则配成500微克 毫升的标准蛋白溶液 Folin 酚试剂甲 Folin 酚试剂乙 3 仪器设备 三 方法和步骤 1 标准曲线的制作 将6支干净试管编号 按下表进行操作 表1 酪蛋白标准曲线的制作 2 样品中蛋白的测定取2支试管 分别加入0 2毫升样品 待测 稀释液 再加入0 8毫升蒸馏水使样品体积达到1毫升 将样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的标准蛋白溶液的浓度 然后乘以稀释倍数 得出未稀释样品含蛋白质的克数 四 实验结果 计算 总蛋白含量 蛋白含量 0 2ml 总体积 注意 蛋白质中酪氨酸含量不同 生色强度不同 所以使用同种

12、蛋白质 同源Pr 作标准 灵敏度比双缩脲反应高100倍 三 紫外光吸收法 一 原理 由于含有酪氨酸和色氨酸 大多数Pr在280nm处有一明显吸收峰 可利用此快速灵敏地测定Pr浓度 由于Pr样品中经常杂有核酸 对280nm光波也有吸收 但不如260nm光波吸收强 可通过统计计算 排除测定Pr含量时核酸的干扰 三 计算CP mg mL F 1 d A280F 校正因子orCP mg mL 1 45 A280 0 74 A260 经验公式 四 优点及缺点优点 灵敏度高 20 100 g mL 方法简单 盐类干扰少 蛋白质不需处理 可回收 缺点 对于测定与标准蛋白质中酪氨酸 色氨酸含量差异较大的蛋白质

13、有一定误差 故适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 四 考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝G 250 CoomassiebrilliantblueG 250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种 考马斯亮蓝G 250在游离状态下呈红色 最大光吸收在488nm 当它与蛋白质结合后变为青色 蛋白质 色素结合物在595nm波长下有最大光吸收 其光吸收值与蛋白质含量成正比 因此可用于蛋白质的定量测定 一 原理 蛋白质与考马斯亮蓝G 250结合在2min左右的时间内达到平衡 完成反应十分迅速 其结合物在室温下1h内保持稳定 该法是1976年Bradford建立 试剂配制简单 操作简便快捷 反应非常灵敏 灵敏度

14、比Lowry法还高4倍 可测定微克级蛋白质含量 测定蛋白质浓度范围为0 1000 g mL 是一种常用的微量蛋白质快速测定方法 1 牛血清白蛋白标准溶液的配制 准确称取100mg牛血清白蛋白 溶于100mL蒸馏水中 即为1000 g mL的原液 2 蛋白试剂考马斯亮蓝G 250的配制 称取100mg考马斯亮蓝G 250 溶于50mL90 乙醇中 加入85 W V 的磷酸100mL 最后用蒸馏水定容到1000mL 此溶液在常温下可放置一个月 3 乙醇 4 磷酸 85 二 试剂 三 操作步骤 1 标准曲线制作 1 0 100 g mL标准曲线的制作 取6支10mL干净的具塞试管 按表1取样 盖塞后

15、 将各试管中溶液纵向倒转混合 放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色 记录各管测定的光密度OD595nm 并做标准曲线 表1低浓度标准曲线制作 四 结果计算 式中 X为在标准曲线上查得的蛋白质含量 g Bradford法的突出特点 1 灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1mg 这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大 蛋白质 染料复合物有更高的吸光系数 因而光吸收要比Folin 酚试剂法大得多 2 测定快速 简洁 只需要加一种试剂 完成一个样品的测定 只要5分钟左右 由于染料与蛋白质结合的过程 大约只要2分钟即可完成 其颜色可以在1小时内保持稳定 且在5分钟至20分钟之

16、间 颜色的稳定性最好 3 干扰物质少 五 注意事项 Bradford法由于染色方法简单迅速 干扰物质少 灵敏度高 现已广泛应用于蛋白质含量的测定 有些阳离子 如K Na Mg2 NH4 2SO4 乙醇等物质不干扰测定 但大量的去污剂如TritonX 100 SDS等严重干扰测定 3 蛋白质与考马斯亮蓝G 250结合的反应十分迅速 在2min左右反应达到平衡 其结合物在室温下1h内保持稳定 因此测定时 不可放置太长时间 否则将使测定结果偏低 一 蛋白质含量的测定 1 凯氏定氮法 灵敏度较低2 双缩脲法 样品量0 2 1 7mg L3 Folin Lowry法 在碱性条件下磷钼酸 磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应 生成蓝色化合物 将其与双羧脲法结合起来 蛋白质形成两种颜色的混合物呈绿色 在650nm具有特定的吸收 灵敏度较高25 g 250 g ml BCA法 1 蛋白质总量的测量 4 考马斯亮蓝法 Bradford法 考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料 在酸性条件下 可与蛋白质上的正电荷结合 形成蓝色化合物 在595nm具有特定吸收 反应简便 快速 灵敏度高 5 50 g ml