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1、植物组织培养母液配置一、实验目的学习配置培养基的母液,掌握配制方法,了解母液存储方法二、实验原理配置培养基时,为了使用方便和用量准确,通常采用母液法进行配置,即按培养基配方中各试剂的用量,扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的 母液置于冰箱中保存,使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。三、实验器材、试剂1器材 电子天平 烧杯(50ml 100ml 500ml 1000ml)量筒(1000ml 100ml 25ml) 容量瓶(100 500 1000)2试剂NH4NO3,KNO3,KH2PO4,CaCl22H2O,MgSO47H2O,FeSO47H2ONa2-EDTA,MnSO44H2O,Z
2、nSO47H2O,H3BO3,KI,Na2MoO42H2OCuSO45H2O,CoCl26H2O,肌醇,甘氨酸,盐酸硫胺素,盐酸吡哆醇,烟酸,蒸馏水四、实验步奏:一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制一般将大量元素配制成10倍的母液,使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的:NH4NO3 、KNO3 ,KH2PO4 、MgSO4.7H2O 、CaCl2.2H2O的量,所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,最后定容至1000ml,转入1000ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期,置于冰箱中保存备用。2、MS微量元素母液的配制一般将微量元素
3、配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取:MnSO44H2O、ZnSO47H2O 、H2BO3 、NaMoO42H2O、 CuSO45H2O、 CoCl26H2O扩大100倍的量,用蒸馏水逐个溶解,待全部溶解后,用容量瓶定容至1000ml,转入1000ml细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期,置于冰箱中保存备用。3、MS铁盐母液配制一般将铁盐配制成100倍的母液,使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的:FeSO47H2O和Na2EDTA?2H2O的量,把FeSO47H2O和 Na2EDTA?2H2O分别置于200ml蒸馏
4、水中,加热并不断搅拌使之溶解(磁力搅拌器,边加热,边搅拌)。保持加热,把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不断搅拌,接近沸腾时停止加热,待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积1000ml,置于棕色细口瓶中,用力振荡12min,贴上标签,注明母液名称、放大倍数、配制日期。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后,再置于冰箱中保存备用。二、植物激素的配置常见激素:2,4D、萘乙酸、吲哚乙酸、6苄氨基嘌呤(6BA)、赤霉素(GA3)、1、生长素类: (1)生长素类:诱导细胞的分裂和根的分化,诱导愈伤组织(2)常见生长素:二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚3丁酸。NAA、IAA、IBA被广泛用于生根
5、,2,4D有利于愈伤组织的诱导和生长。(3)保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存2、细胞分裂素 细胞分类素:促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合,用以调节细胞分裂,细胞伸长,细胞分化和器官形成。 (1)常用的细胞分裂素有: 6苄氨基嘌呤(6BA)、激动素KT)、玉米素、噻二唑苯基脲(2)保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存3、赤霉素(GA3) (1)保存:配成一定浓度后,冰箱冷藏保存 (三、培养基的制备与灭菌(一)、培养基的制备1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好,将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水,按照培养基配方所需
6、量依次取母液和植物激素加入烧杯,搅拌,按相应培养基称量蔗糖和琼脂,并添加到烧杯中,在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。3、充分混合后,用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为培养基要求pH值。4、趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。(二)、培养基的灭菌灭菌温度及灭菌时间:121(1.06kg/cm2)下灭菌20分钟。(如是实验所用菌材灭菌,如无菌水及器械,则是121(1.06kg/cm2)下灭菌30分钟)1、检查灭菌锅外层锅内水位,水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。2、盖上锅盖,注意按照说明操作并确定已盖好,设置好温度和时间参
7、数,开启电源加热灭菌。3、灭菌时间到后,先切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,待灭菌锅压力表指针降到0时,打开排气阀,旋松螺栓,开启锅盖,取出已灭菌的培养基。4、刚灭过菌的培养基成液体状,取出时不要用力摇动,否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天,观察有无微生物生长,以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。五、培养基凝固不好的原因1.培养基组分中琼脂的用量和质量 2. PH值试纸检测培养基的酸碱度,看培养基是否过酸,一般PH值低于4.8时凝固不良,过酸加氢氧化钠,过碱加盐酸;当需要较酸的培养基时,可以适当增加琼脂的用量。 3. 灭菌时间过长,一般在0.15MPa超过1小时后易凝固不良。 4.考虑称量工具是否准确,有些小市场买的称量工具不是很准确。