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1、肿瘤分子诊断服务介绍 2 标准化用药 个体化用药 标准化用药 个体化用药 标准疗法1 标准疗法2 标准疗法3 3 肿瘤药物与相关靶标 4 如何实现个体化用药 分子分型药物疗效 5 6 体细胞基因突变检测 mRNA表达检测 循环肿瘤细胞 CTC 检测 基因多态性检测 7 体细胞基因突变检测 EGFR K RAS B RAF C KIT 8 1 基因突变检测技术 qPCR HRM 可用于血浆标本检测 Taqman ARMS 与国际获批的技术相当 DNA测序 基因突变检测的金标准技术 9 突变检测技术之一Taqman ARMS 所有定量PCR仪均可使用 主要用于各类组织 包括手术 穿刺或镜检组织类
2、2小时即可完成检测试剂盒商业化程度高 临床认可程度高国内已有试剂盒获批SFDA 10 突变检测技术之一qPCR HRM qPCR HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析 High ResolutionMelting 技术 灵敏度可以达到1 0 1 既能检测已知突变 也能检测未知突变 qPCR HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证 JournalofMolecularDiagnostics Vol 11 No 6 November2009 实例图 利用HRM技术对7个样本分别进行EGFR 左图 KRAS 右图 突变检测 红色表示该样本发生突变 蓝色表示未突变 蓝色横直线为阴
3、性对照 左图显示2个样本发生了EGFR突变 右图显示4个样本发生了KRAS突变 EGFR KRAS 11 血浆EGFR突变检测 18号外显子 无突变19号外显子 突变20号外显子 无突变21号外显子 无突变附图 主要特点 实现血浆中来自肿瘤的微量DNA的突变检测 目前所做的临床实验中 血浆EGFR检测结果与其手术标本之间的整体符合率符合率达到91 25 是临床上不能手术 也同时不愿穿刺患者的替代检测方案 也可获得性耐药进行预先检测 qPCR HRM用于血浆微量突变检测 12 国际公认的分子检测金标准有明确的物价收费实验流程较复杂 需要大型仪器 突变检测技术之一DNA测序 13 突变检测项目列举
4、 14 EGFR突变检测 EGFRE19 E21敏感突变适合使用TKI药物治疗 耐药位点检测T790M 15 K RAS突变检测 16 BRAF NCCN 2010年NCCN 结直肠癌临床实践指南 指出 K ras基因为野生型而同时具有BRAFV600E突变的患者 靶向EGFR抗体治疗无效 BRAF V600E检测 肿瘤学临床实践指南 中国版 2010第一版 17 指导肿瘤靶向治疗的靶标 18 基因多态性检测与药物代谢毒性 UGT1A1 CYP DPD 6 15 2020 19 单核苷酸多态性 SNP 是最常见的基因变异 至少1 的人群 绝大多数人群 共有序列 GtoC SNP位点 变异的序列
5、 最常见的基因多态性SNP 6 15 2020 20 为什么SNPs重要 个体1 个体2 SNPvariationsinDNA SNP标志基因A 基因B 基因A SNP可能使基因B产生变异的蛋白质分子 6 15 2020 21 个体的SNP谱 SNP谱A SNP谱B SNP谱C SNP谱F SNP谱E SNP谱D 6 15 2020 22 SNP谱有助于确定药物的疗效和副作用 乳腺癌病人 个体的SNP谱可以分成不同的类型 SNP谱A 对药物有期望的反应 对药物没有期望的反应 SNP谱A的人对药物有期望的反应 SNP谱E SNP谱B SNP谱C SNP谱D 23 药物代谢与SNP检测 化疗药物在
6、体内经过吸收 代谢 分布和清除 通过其活性物质对治疗靶点的直接攻击而发挥作用 整个过程需要多种蛋白质 酶的共同参与和协同作用 SNP主要是指在基因组水平上变异频率大于1 的单核苷酸变异所引起的DNA序列多态性 多态性会导致不同个体体内各种蛋白 酶活性的差异 因此导致药物使用情况的不同 24 胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因 UGT1A1 UGT1A1 27 C686A 或UGT1A1 28 TA 7TAA 野生型 6个TAUGT1A1 6 G211A 使UGT1A1的转录活性下降了三分之二 导致对伊立替康的毒性增加 FDA提示 UGT1A1的多态性 伊立替康的毒性增加 6TA 此型的酶活性
7、是野生型的49 25 CYP19A1多态性影响芳香化酶抑制剂疗效 CYP19A1是芳香化酶的编码基因 临床研究已证实有着很大的影响作用 在接受芳香化酶抑制剂治疗的乳腺癌患者中 携带CYP19A1基因rs4646 G T 突变患者的治疗效果较无此突变的患者显著2 4 下图 CYP19A1rs4646 G T SNP是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标 如图一项对乳腺癌患者的临床研究显示 CYP19A1基因rs4646突变的患者使用芳香化酶抑制剂药物疗效明显优于野生型患者 p 0 0001 1 参考文献1 IanESetal NEnglJMed 2003 384 2431 42 2
8、 RamonCetal ClinCancerRes 2008 14 811 6 3 LunardiGetal JClinOncol 2009 27 555 4 FaschingPAetal BreastCancerResTr 2008 112 89 98 26 基因表达检测 mRNA表达 ERCC1 BRCA1 TUBB3 TS 27 基因表达检测指标 靶向药物 28 28 HER2基因表达检测 采用RT PCR方法替代FISH或免疫组化方法 临床准确率达97 以上 主要特点 客观 不用人为观察 时间短 整个检测60分钟左右完成 高通量 一次可以检测6人份 29 PDGFR 低表达患者的无进展
9、生存期和总生存期明显长于高表达患者 30 31 化疗药物与检测靶标 32 ERCC1表达与铂类药物疗效相关的临床数据 ERCC1阴性患者 能从铂类辅助化疗中获益 33 BRCA1 2表达与铂类药物疗效相关的临床数据 BRCA1过度表达铂类耐药的预测因子抗微管类药物的敏感因子 34 低TSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好 中位生存期较长 TS低表达的患者对培美曲赛的疗效好 TS高表达影响氟类和培美曲塞药效 ShirotaYetal JClinOncol 2001 19 4298 304 35 化疗药物与检测靶标 36 小结 37 NSCLC个体化用药系统方案 38 遗传性非息肉性结直
10、肠癌 HNPCC 是由DNA错配修复基因 MMR 发生基因突变导致的一种单基因的显性遗传疾病 又称lynch综合症 发生基因异常的个体其患发结直肠癌的风险约为60 HNPCC实验室检测流程 39 1背景介绍之HNPCC与MMRMSI 目前已发现的导致人类HNPCC发生的MMR有MSH2 MLH1 MSH6 PMS1 PMS2 其中MSH2和MLH1基因的功能最重要 其突变占已发现突变的90 左右 40 1背景介绍之HNPCC与MMRMSI 研究显示 约有86 95 的HNPCC具有MSI特征 而散发型大肠癌中只有16 MSI所产生的遗传不稳定性将加速恶性肿瘤的发生 1997年美国NCI nat
11、ionalcancerinstitution 将MSI确定为检测和筛选HNPCC的重要方法之一 并推荐将BAT26 BAT25 D2S123 D5S346和D17S2505个位点作为检测HNPCC的位点 41 实验室检测流程 42 HNPCC检测项目 43 标本要求 44 肿瘤在变 WecanlookattumorsforchangesattheDNA RNAandproteinlevels Itcertainlygivesusawayoflookingatwhatishappeninginsideatumor andthat sveryexciting Dr GordonMillsChair
12、SystemsBiologyMDAndersonCancerCenterHouston TxAsreportedin TheCancerTest TIME June14 2007 45 循环肿瘤细胞 1869年AustMedJ Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到 2005年NEnglJMed Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子 循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞 46 获取CTC需要解决的技术问题 从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞将恶性肿瘤细胞与红细胞 白细胞 正常上皮细胞 造血干细胞等
13、区分开来 每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞 而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个 红细胞有500亿个 47 三种技术 过滤法 ISET IsolationbySizeofEpithelialTumorcells8 m孔径过滤膜 漏检体积较小的肿瘤细胞敏感性低 梯度密度法 肿瘤细胞和单核细胞密度小于1 077g mlCTC纯度低 混入较多白细胞肿瘤细胞会迁移至血浆层 而聚集后容易下沉聚蔗糖 泛影葡胺 Ficoll Hypaque 对细胞有毒性 免疫磁珠法 肿瘤细胞表面抗原EpCAM与包绕着磁珠的特异性单抗相结合CellSearch细胞保存方法长达96小时实验室室间差异小EpC
14、AM的假阳性和假阴性 48 CellSearch是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞 CTC 产品 1983磁流体 49 如何鉴别出CTC CTC Anti EpCAM磁珠 Anti CK PE NucleusDAPI CK EpCAM 在CellSearch 检测中 CTC被设定为 EpCamCK 8 18和 或19DAPICD45 50 CellSave 储存管 CellSearch CTC检测试剂盒 CellSearch 自动化的CTC分离 富集和计数 磁巢Magnest CellTracks AnalyzerII 96小时稳定 2004年FDA批准 CTC质控试剂盒 磁力捕获 FIRSTANDONLY APPROVED 51 切点的意义 评估预后 52 CTC数量变化是预后改变的重要预测 53 CTC的应用 从细胞计数到分子特性
