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1、 第三章植物基因的克隆原理与技术 内容 一 基因克隆所需要的酶和载体二 植物转化载体的构建三 基因克隆的方法 基因克隆所需要的酶和载体 一般认为基因工程诞生于1973年上世纪40年代 70年代初分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明对于基因工程的诞生起到了决定性的作用 1 DNA是遗传物质被证实 1944年 AveryO T 肺炎双球菌转化实验 1953年 JamesWatson和FrancisCrick提出了DNA的双螺旋模型 以Nireberg等为代表的一批科学家确定了遗传信息以密码方式传递 每三个核苷酸组成一个密码子 代表一个氨基酸 到1966年 全部破译了64个密码子 并提出
2、了遗传信息传递的 中心法则 Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII 1972年 Boyer等相继发现了 coRI一类重要的限制性内切酶 WernerArber1968年发现限制酶 1967年 世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶 特别是1970年Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性 1970年 Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶 完善了中心法则 使单个真核基因的制备成为了可能 1972年 美国Stanford大学的P Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组 1973年 Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性
3、状的转移 这一年被定为基因工程诞生的元年 植物基因工程的基本流程 基因克隆所需要的酶类 限制性内切核酸酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA修饰酶核酸外切酶单链DNA内切酶 1 限制性核酸内切酶的发现2 限制性核酸内切酶的命名和分类3 II型限制性核酸内切酶的基本特性4 限制性核酸内切酶的消化反应 限制性核酸内切酶 限制性内切核酸酶的发现50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统 1968年 Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶 1970年 Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核
4、酸内切酶HindII 使得DNA分子的体外精确切割成为可能 限制 Restriction 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断 修饰 Modification 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护 不能被自身的限制性内切酶识别切割 限制性核酸内切酶的概念 限制性核酸内切酶 Restrictionendonucleases 是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列 并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶 已经从近300种微生物中分离出了2300种 其中商品化的限制性核酸内切酶500余种 限制性核酸内切酶的命名 1 寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成
5、3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称 如 大肠杆菌Escherichiacoli表示为Eco 属名 流感嗜血菌Haemophilusinfluenzae表示为Hin 种名 2 修饰性酶用M表示 限制性酶用R表示如R HinM Eco3 用一个正体字母表示菌株的类型如EscherichiacoliRY13EcoR4 以罗马数字表示分离出来的先后顺序如EcoRI HindIII 限制性内切核酸酶类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶 I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶 限制性核酸内切酶的分类 不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析 I型 II型 III型 限制 修饰活性 单
6、一多功能的酶 限制酶和修饰酶分开 双功能酶 内切酶的蛋白质结构 3种不同亚基 单一成分 2种不同亚基 活性辅助因子 ATP Mg2 SAM ATP Mg2 SAM Mg2 甲基化位点 寄主特异性的位点 特异性切割 否 是 否 基因克隆中的用途 用途有限 十分广泛 用途有限 II型限制性核酸内切酶的3大特点 识别位点的特异性识别序列的对称性切割位点的规范性 与II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端 cohesiveends 因酶切位点在两条DNA单链上不同 对称 酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构 酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来 5 端凸出 如EcoRI 3
7、端凸出 如PstI 平末端 Bluntend 因酶切位点在两条DNA单链上相同 酶切后形成的平齐的末端结构 这种末端不易重新连接起来 同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶 完全同裂酶识别位点和切点完全相同如Hind 和HsuI 不完全同裂酶识别位点相同但切点不同如XmaI和SmaI XmaI5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 SmaI5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同 但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶 注意 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接 但是两种同尾酶消化产生的粘
8、性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别 BamHI GGATCC CCTAGG 5 3 3 5 BglII5 AGATCT 3 3 TCTAGA 5 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图 5 XXXXGGATCCXXXXXX3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX5 BamHI 5 XXXXGGATCCXXXXXX3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX5 5 XXXXAGATCTXXXXXX3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX5 BglII 5 XXXXAGATCTXXXXXX3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX5 5 XXXXAGATCCXXXXXX3 3 XXXX
9、TCTAGGXXXXXX5 5 XXXXAGATCCXXXXXX3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX5 BamHI BglII 影响酶活性的因素很多 DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素纯度的鉴定 紫外吸光值A260 A280浓度低于500ng L酶切消化的缓冲液Mg2 Tris HCLBSA 牛血清蛋白 酶切反应的温度 通常为37 影响酶切消化的其他因素时间体积RNA 限制性核酸内切酶的消化反应 酶切反应的基本步骤 Buffer 10 2 0 LWater16 5 LDNA1 0 LEnzyme0 5 LVolume20 0 L 1 0kb 0 4kb 0 5kb 0 6kb 1
10、 DNA连接酶作用的机理2 DNA连接酶的反应条件3 DNA连接的策略 DNA连接酶及其应用 DNA连接酶的发现 T4DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 以ATP作为能源辅助因子 容易制备 而且可以连接完全配对的平末端DNA分子 所以在基因克隆中应用广泛 DNA连接酶 由大肠杆菌基因组DNA编码 以NAD 作为能源辅助因子 从细菌DNA环化现象推测 必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶 DNA连接酶作用的特点 A 连接的两条链必须分别具有3 端自由羟基 OH 和5 端磷酸基团 P 而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应 B 连接反应必须有能量分子的参与 通常有两种能量分
11、子 即ATP和NAD DNA连接反应的条件 CK CK 重组菌 影响连接效率的因素有 温度 最主要的因素 dNTP的浓度 10 M 1 M 连接酶浓度 平末端较粘性末端要求高 反应时间 通常连接过夜 插入片段和载体片段的摩尔比 平末端DNA片段的末端加尾连接法 平末端DNA片段加接头连接法 衔接物 linker 也叫接头 是有人工化学合成的一段10 12个核苷酸的DNA双链 其中包含有1个或几个限制性酶切位点 使用时只须将衔接物和目的片段的5 端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化 然后用T4DNA连接酶进行连接 就可获得能产生粘性末端的DNA片段 CCGAATTCGGGGCTTAAGCC 磷酸化 C
12、CGAATTCGGGGCTTAAGCC P OH OH P P P OH OH T4连接酶 CCGAATTCGGGGCTTAAGCC P OH P OH EcoRI CCGAATTCGGGGCTTAAGCC AATTCGGGCC CCGGGCTTAA 大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶Taq聚合酶逆转录酶 DNA聚合酶及其应用 常用DNA聚合酶的特性比较 逆转录酶一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶 其产物称为cDNA complementaryDNA 实际上 是一种RNA依赖的DNA聚合酶 来源RNA肿瘤病毒 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母
13、细胞瘤病毒 avianmyeloblastosisvirus AMV 和鼠白血病毒反转录酶 avianmyeloblastosisvirus M MLV AMV的性质由 和 两条多肽链组成 聚合酶活性和RNaseH活性 RNaseH 经过蛋白酶水解后产生的一条多肽 以5 3 或3 5 方向特异地水解RNA DNA杂交双链中的RNA链 RNaseH RNA DNA 逆转录酶的用途合成cDNA以oligodT为引物 与mRNA的polyA尾巴互补结合 RT PCR用的模板克隆某个基因时 用其mRNA反转录出cDNA第一链 mRNA5 AAAAAA TTTTTT 3 5 DNA修饰酶末端脱氧核苷酸转
14、移酶T4多核苷酸激酶碱性磷酸酶 细菌性碱性磷酸酶Bacterialalkalinephosphatase BAP从大肠杆菌中分离出来 具有抗热性 碱性磷酸酶 小牛肠碱性磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase CIP从小牛肠中纯化出来 SDS中加热68 可完全失活 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA 或RNA 5 端的磷酸根 碱性磷酸酶 Hind 酶切 5 AAGCTTTTCGAA5 碱性磷酸酶 易载体自连 碱性磷酸酶的功能 防止线性化的载体份子自我连接 外源DNA 连接酶 转入细菌后会被修复 基因工程载体 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达
15、而目的基因本身无法进行复制 所以就必须借助于 载体 及其 寄主细胞 来实现 分子较小 可携带比较大的DNA片段 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制 要有尽可能多种限制酶的切割位点 但每一种限制酶又要最少的切割位点 多克隆位点multiplecloningsites MCS 有适合的标记 易于选择 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 并且尽可能是高效的表达 从安全角度考虑 要求载体不能随便转移 仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等 载体需要满足的条件 载体分类根据功能分 克隆载体 克隆一个基因或DNA片断表达载体 用于一个基因的蛋白表达整合载体 把一个基因插入到染色体组中
16、根据来源 质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体 质粒载体 质粒载体 plasimidvectors 1 质粒载体的生物学特性2 质粒载体相关知识介绍 1 质粒载体的生物学特性 1 质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制 的裸露的环状双链DNA分子 比病毒更简单 在霉菌 蓝藻 酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒 目前对细菌的质粒研究得比较深入 特别是大肠杆菌的质粒 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存 质粒的存在形式 有超螺旋 开环双螺旋和线状双螺旋3种 双螺旋共价闭合环 超螺旋 开环双螺旋 一个裂口 线状双螺旋 两个裂口 质粒DNA的分子构型 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图 L 松弛线性的DNA 松弛开环的OC构型 超螺旋的SC构型 作为基因工程载体 质粒至少应该具备复制的起始区 选择标记基因区 多克隆位点等部分 多克隆位点功能 用于插入外源DNA片段的特定区域 由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成 特点 每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的 选择标记基因 在基因工程中的一类用于选择转化细胞 菌 的抗性基因 功能 通
