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1、项目类别项目批准号 BL05088附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称： 紫灵芝多肽的提取及其成分分析 申 请 人： 饶瑞娟 所在院部： 生命科学学院 专业年级： 02生物技术3班 联系电话： 13660100421 指导教师: 高向阳 职称 副教授 立项日期： 二五 年 四 月 一 日结题日期： 二六 年 四 月 一 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明1. 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原
2、件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。1. 简表项目简况项目名称紫灵芝多肽的提取及其成分分析项目类别A、文科类； B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.42006.4项目组成员姓 名性别出生年月
3、年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字饶瑞娟女1983.1102生技3生命科学学院62.48全面研究指导教师情况姓名高向阳性别女学位博士职称副教授研究方向酶学与酶工程、生物制药授课名称生物化学、酶工程、生物分离技术等项目简介本项目对广东东莞市英芝堂生物工程公司半固态发酵法生产的紫灵芝（康元1号）进行了氨基酸成分分析，样品中总氨基酸含量为23.281g37.236g（g/100g），检测到18种氨基酸，其中，谷氨酸和天门冬氨酸的含量最大。以半固态发酵法生产的紫灵芝湿料（含水分4550）为材料，经热水、乙醇两种方法提取、用SephadexG-100分离纯化得到紫灵芝多肽。本项目的
4、特色在于从灵芝中提取多肽（蛋白质），分析各种蛋白质的氨基酸组成和性质，找出对人体有益的蛋白质成分，并将其研制成口服液，能提高人们的免疫力，增强体质，具有防治肿瘤的作用。本项目成功后即可投入生产，有广阔的市场前景。目前该项研究还未见报道，亦未见同类产品上市。二、项目研究的内容与方法分离纯化电泳提取1、技术路线鲜菌体 提取液 蛋白质图谱 纯品 产品研制2、材料与方法2.1 材料广东东莞市英芝堂生物工程公司半固态发酵法生产的紫灵芝（康元1号）湿料（含水分4550）3.多肽提取 3.1拟用两种方法提取3.1.1 生理盐水提取 10g材料加50mL生理盐水研磨提取30min，离心（3000r/min，室
5、温，10min），残渣反复提取一次，合并上清液。对上清液透析过滤，即为提取液。3.1.2 30（V/V）乙醇水溶液 50g材料加入250mL30预冷（8）乙醇溶液研磨提取30min，离心（条件同上）。重复一次，合并上清液，复加预冷（0）乙醇至65（V/V）浓度，置冰箱沉淀4h以上，倾出上层清液，离心（条件同上），收集沉淀，抽干，真空干燥。3.2 电泳 SDS-PAGE垂板电泳（1）样品的变性浓缩 取0.5mL各样品加入2mL甲醇摇匀，再加0.5mLCHCl3摇匀，再加1.5mL水剧烈振摇后，离心（4000r/min，5min）吸去上层水层后，加入1.5mL甲醇，轻轻摇匀，出现絮状沉淀。离心（4
6、000rpm，5min），弃上清，沉淀于空气中干燥备用。 取15L水15L裂解液溶解沉淀，用枪反复吸冲壁，再吸10L水10L裂解液冲一下，稍微加热后离心收集，吸取上层至指形管中，把指形管放加热板中加热3min（100），离心，取上清液上样。（2）电泳 用溶解的2的琼脂封好玻璃板，静止琼脂凝固。加入dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水。按下表配下层胶（分离胶），胶浓度（12），混匀，灌胶，高度离梳子约1.52cm，然后覆盖一层dH2O，凝胶时间为1540min，胶与水分层，倾倒去水。配上层胶（浓缩胶），胶浓度5，混匀，灌胶，插入梳子。加入稀释的电极缓冲液，用微量注射器点样，2535L（注意
7、做好记号），注意不要交叉污染。恒电压电泳：浓缩胶，80V，约1h；分离胶，160V，约3h。电泳后染色23h，50；再加脱色液处理23h，50，即可看到条带。表1 分离胶和浓缩胶的配制分离胶（12）浓缩胶（5）凝胶贮液 308mL1.62mL上层胶缓冲液 pH6.85mL下层胶缓冲液 pH8.810mLSDS0.1mL0.1mLTEMED（四甲基乙二胺）20L14LdH2O1.3mL3mLAP（过硫酸氨）0.3mL0.14mL3.3 蛋白质含量测定 按考马斯亮蓝G-250法，并以牛血清白蛋白为标准蛋白质。取6支管，按下表数据配制01000g/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。表2 标准蛋白溶液配制
8、试剂管号1234561000g/mL牛血清白蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蛋白质浓度（g/mL）02004006008001000准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯再595nm下比色，作出标准曲线。吸取提取液0.1mL放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用10mm光径比色杯再595nm下比色，记录消光值，并通过标准曲线查得每毫升溶液中蛋白质的含量，以蒸
9、馏水作空白样。4.多肽的分离纯化4.1 提取液脱色 采用2活性炭，离心或过滤。4.2 纯化 采用过凝胶柱Sephadex G-100纯化。4.3 纯度检测 电泳法，具体方法步骤同SDS-PAGE垂板电泳。上样量为1520L。5、氨基酸组成分析 采用氨基酸自动分析仪。三、项目研究过程与资料查阅情况项目研究过程(一)考马斯亮蓝G-250染色法标准曲线按考马斯亮蓝G-250染色法绘制标准曲线，每个标准含量的蛋白质溶液分3管，测定3个平行数据，取其平均值，作出下图。用考马斯亮蓝G-250染色法测定样品蛋白质含量，过柱前OD595nm为1.208，过柱后，将处于波峰的管2844中的收集液合并，经过浓缩后
10、，测定其OD595nm为0.639，根据标准曲线，蛋白质含量分别为1653g/mL和840g/mL。可见，过柱以后蛋白质纯化效果明显。（二）电泳结果分析图1 SDS-PAGE电泳照片图1是SDS-PAGE的电泳照片，由于在电泳凝胶中加入了SDS，使蛋白质中的亚基裂解。可能此蛋白质中含有大量的亚基，从而使电泳条带过多而模糊不清，但标准蛋白仍清晰可见，可以说明电泳方法没问题。但由于可能使样品本身或者是样品处理过程中的问题，从而导致了电泳结果的不理想。(三) 氨基酸分析采用日立氨基酸自动分析仪检测氨基酸组成，有2样品GF0503，GF0504，结果如表3。从表中可见，紫芝蛋白质中的氨基酸成分有18种
11、。样品GF0503的总氨酸含量为23.281g，GF0504的总氨酸含量为37.236g。（含量以g/100g计）表3紫灵芝脂溶性成分中氨基酸的组成样品名称氨基酸GF0503GF0504天门冬氨酸3.1244.790丝氨酸1.1161.823谷氨酸5.6018.591甘氨酸0.7451.313组氨酸0.5160.963精氨酸1.3082.218苏氨酸0.8161.319丙氨酸0.9931.570脯氨酸0.9751.623胱氨酸0.7591.131酪氨酸0.7801.256颉氨酸0.9841.574蛋氨酸0.4990.762赖氨酸1.3312.210异亮氨酸1.1691.895亮氨酸1.4582
12、.404苯丙氨酸0.8891.496色氨酸0.2180.298总氨酸23.28137.236备注含量以g/100g计资料查阅情况1 赵亚华，高向阳.生物化学实验技术教程.广州:华南理工出版社，20002 陆文墚，林忠平，林志彬.灵芝 北京:科学出版社，19853 何云庆等.北京医科大学学报，1989；21（3）：2252274 赵继鼎，徐连旺，张小青.中国灵芝 北京:科学出版社，19815 鲁子贤主编.蛋白质和酶学研究方法M.北京:科学出版社，19896 罗立新，姚汝华，周少奇.食品工业科技，1998；3：477 鲁子贤主编.蛋白质和酶学研究方法M.北京:科学出版社，1989四、项目成果完成形式和价值1 从灵芝中提取多肽并分离纯化，过柱前后蛋白质含量分别为1653g/mL和840g/mL。可见，过柱以后蛋白质纯化效果明显。2 采用日立氨基酸自动分析仪检测氨基酸组成，有2样品GF0503，GF0504，结果如表3。从表中可见，紫芝蛋白质中的氨基酸成分有18种。样品GF0503的总氨酸含量为23.281g，GF0504的总氨酸含量为37.236g（含量以g/100g计）。从氨基酸的组成分析上看，谷氨酸和天门冬氨酸的含量最大，谷氨酸对调节神经功能有重要的作用，
