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1、第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛 作品名称：H1N1 SIV HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立 申报者姓名 （集体名称）： 谢易恒 李栋 苏培穗 陈成果 周科 黄慧雄 类别： 自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类报送方式： 省级报送作品高校直送作品H1N1 SIV（猪流感病毒）HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立摘要：猪是流感病毒传播的中间宿主，猪感染猪流感病毒（SIV）后会导致其他疾病如蓝耳病、圆环病毒病、胸膜肺炎等疾病的发生，给畜牧业造
2、成巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA)基因在流感病毒传染的过程中与识别靶细胞表面受体在穿膜过程中起重要作用，刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。本论文采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒（SIV）广东株的血凝素（HA）基因，测序后对HA 基因进行生物信息学分析，分析结果表明HA蛋白具有良好的免疫原性，可以作为诊断试剂。然后将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上，成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达，SDS-PAGE可检测到分子量约
3、为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5。经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90以上是以可溶形式表达的。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的间接ELISA方法，为猪流感的防控奠定基础。关键词：H1N1亚型猪流感病毒 血凝素（HA） 生物信息学 高效可溶表达 单克隆抗体 ELISA方法Biological inform
4、ation analysis and high soluble expression of HA protein of H1N1 subtype Swine Influenza Virus along with establishment of an ELISA assay to diagnose SIVAuthor ：Xie Yi-heng，Li Dong，Su Pei-sui，Chen Chen-guo，Zhou Ke，Huang Hui-xiongDirector teacher: Xie Qing-mei associate professorAbstract：Swine is an
5、intermediate of spreading influenza virus, swines infected influenza virus will bring on other diseases such as PRRS, PCV, APP ,causing economic loses in the stockbreeding and intimidating the health of human so that fast diagnosis and timely analysis are the first step to control the influenza viru
6、s. The HA gene of H1N1 subtype influenza virus isolated from Guangdong Province was successfully amplified by RT-PCR,then analyzed biological information after translating DNA suquences. And the HA fragment was inserted into plasmid pBCX to obtain recombinant plasimd in which HA gene was fused into.
7、 The pMBX-HA was transformd into E.coli BL-21(DE3) to induce HA gene fusion expression. The fusion protein band with relative molecular mass of 94000 was detected on the SDS-PAGE gel, and the soluble expression products accounted for 29.5% of the total E.coli proteins. The soluble form of the expres
8、sion products was up to 90% the fusion protein. From western-blot analysis of recombinant protein HA, the expression fusion protein and positive blood serum of H1N1 SIV have favorable immunogenicity. Expressed protein HA is used for coating antigen to sublimate monoclonal antibody of swine influenza
9、 virus. The preparations of monoclonal antibody of swine influenza virus are used for establishing an indirect ELISA assay to diagnose SIV in order to prevent and control the swine influenza virus .Key words：H1N1 subtype Swine Influenza Virus haemagglutinin bioinformatics high soluble expression mon
10、oclonal antibody method of ELISA猪流感是由猪流感病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病。1975年以前，H1N1猪流感病毒以地方流行性存在于欧美大陆，其他地方少有报道；70年代末，H1N1猪流感传入了我国台湾，香港和大陆等地，并在亚洲广泛盛行。有研究表明我国H1N1抗体阳性率有不断上升的趋势。猪流感病毒具有感染人的潜力。据报道1976年，美国新泽西州的一名新兵感染猪源H1N1而死于肺炎。作为流感病毒的“混合器”，猪流感病毒在禽猪人的种间传播中起到非常重要的作用。另外人类流感和猪流感爆发的平行性和相关性,赋予了猪流感非常重要的公共卫生意义。生物信息学是
11、一门新兴的交叉学科，是采用计算机技术和信息论方法究蛋白质及核酸序列等各种生物信息的采集、存储、传递、检索、分析和解读的科学。具体的说，生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测。应用生物信息学分析H1N1亚型猪流感病毒HA基因及其氨基酸序列，打破传统的实验模式，开创了“理论实验理论”的新模式。DNA重组技术又称基因工程技术，为大量获得蛋白质/多肽（以下所称“蛋白质”和“多肽”通用）提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。本研究选用pBCX高效可溶
12、表达载体高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高可溶性多肽，本身在大肠杆菌中表达量很高，其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性。当被诱导表达时，msyB多肽作为载体可与同外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的胞质中表达，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表达的外源蛋白能够产生正确折叠。对那些在胞内表达且表达产物对细菌有毒性的外源基因来说，可以减弱其毒性，提高表达量，提高融合蛋白的稳定性。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可
13、溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。近年来，融合蛋白被广泛应用于生物研究，因其具有双方蛋白的活性，可被用于蛋白的表达、检测、识别和纯化。特别是在免疫治疗和免疫分析以及寻求高效、新型重组药物方面显示了其特有的优势。融合蛋白使昂贵的细胞因子在兽医上的应用成为可能，由融合蛋白构建的“生物导弹”更是提高了药物的效力，因此融合蛋白表达技术是极具发展前景的一门技术。本研究对猪流感病毒HA基因的进行了生物信息学分析和高效可溶表达，纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了检测H1N1亚型SIV的夹心ELIS
14、A方法，为防治猪流感和研制猪流感基因工程疫苗提供科学依据，对生产实践具有一定的指导意义。1 材料1.1 病毒猪流感病毒毒株：A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)。1.2 菌种基因工程宿主菌E.coli DH5、表达菌E.coli BL-21（DE3）。pGEM-T Easy载体质粒（图1）系统为Promega公司产品; pBCX质粒（图2）本实验室保存。图1 质粒pGEM-T Easy的结构示意图Fig.1 Sketch map of the plasmid pGEM-T Easy图2 pBCX载体的结构示意图Fig.2 Sketch map of the plasmid
15、Pbxc Easy1.3 常用培养基以及试剂LB液体培养基、LB固体培养基、LA固体培养基（含氨苄青霉素100g/mL）、氨苄青霉素100mg/mL、无RNA酶的DEPC水、AMV反转录酶（5U/L）、HRP RNA酶抑制剂（40U/L）、小牛碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶及相应缓冲液，Ex Taq DNA聚合酶（5u/L）、dNTPs（2.5mM each）、DL2000 DNA Marker、DEPC、IPTG、Amp、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、TEMED、6xHis-Tag 融合蛋白亲和层析Ni-NTA 凝胶、DNA片段快速纯化/回收试剂盒、质粒DNA抽提试剂盒。1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）、5SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）。1.5 Western blot试剂转移缓冲液：25mM Tris，192mmol/L甘氨酸，20%（v/v）甲醇，0.037%（v/v）SDS，用HCl调pH至8.3。TBS缓冲液：150mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-Cl（pH7.5）。封闭液：5%脱脂奶粉，用TBS缓冲液配制，4保存。抗体稀释液：1
