沉淀法教程

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1、第四章沉淀法 precipitation 生物分离过程的一般流程 第一节沉淀法概述第二节盐析法第三节有机溶剂沉淀法第四节等电点沉淀法第五节其他沉淀方法第六节沉淀法应用 本章主要内容 一 沉淀法的概念利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 第一节概述 二 沉淀法的目的 浓缩 有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分 初步纯化 将已纯化的产品由液态变成固态 加以保存或进一步处理 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法 但目前仍广泛应用在工业上和实验室中 三 沉淀法操作步骤 首先加入沉淀剂 沉淀剂的陈化 促进粒子生长 离心或过滤 收集沉淀物 四 沉淀生成动力学溶解度降低是

2、一个动力学过程 当体系变得不稳定以后 分子互相碰撞并产生聚并作用 通常认为相互碰撞由下面几种运动引起 热运动 Bromnian运动 对流运动 由机械搅拌产生 差示沉降 由颗粒自由沉降速度不同造成的 为了简化沉淀过程动力学 可把沉淀过程分成下述 个步骤 1 初始混合 2 新相生成 3 布朗运动凝集 4 机械碰撞凝集 5 聚集体陈化 6 聚集体沉淀 沉淀法不仅用于实验室中 因其不需专门设备 且易于放大 也广泛用于生产 是分离纯化生物大分子 特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法 优点 操作简单 经济 浓缩倍数高缺点 针对复杂体系而言 分离度不高 选择性不强 五 沉淀法的特点 六 沉淀法的分类 根据所加

3、入的沉淀剂的不同 沉淀法可以分为 1 盐析法 2 等电点沉淀法 3 有机溶剂沉淀法 4 非离子型聚合物沉淀法 5 聚电解质沉淀法 6 复合盐沉淀法等 7 亲和沉淀法 8 选择性沉淀法 七 蛋白质的溶解特性 在水溶液中 疏水残基具有向内部折叠的趋势 部分暴露在外表面 形成疏水区 疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大 疏水性强 亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面 因此 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区 亲水区和疏水区构成 1 蛋白质周围的水化层 hydrationshell 保护了蛋白质粒子 避免了相互碰撞 使蛋白质形成稳定的胶体溶液 2 蛋白质分子间静电排斥作用 蛋白质表面的电荷

4、与溶液中反离子的电荷构成双电层 第二节盐析Saltinducedprecipitation 一 盐析的概念 在高浓度的中性盐存在下 蛋白质 酶 等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低 产生沉淀的过程 盐析是可逆的 而变性是不可逆的 二 盐析法机理 1 破坏水化膜 分子间易碰撞聚集 将大量盐加到蛋白质溶液中 高浓度的盐离子有很强的水化力 于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集 2 破坏水化膜 暴露出憎水区域 由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀 憎水区域越多 越易沉淀 3 中和电荷 减少静电斥力 中性盐加入蛋白质溶液后 蛋白质表面电荷大量被中和 静电斥力降低 导致

5、蛋白溶解度降低 使蛋白质分子之间聚集而沉淀 中性盐盐析法机理示意图 三 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况 1 盐溶 现象 salt in 低盐浓度下 增加蛋白质分子间静电斥力 蛋白质溶解度增大 2 盐析 现象 salt out 高盐浓度下 中和电荷 破坏水化膜 蛋白质溶解度随之下降 盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富 经济 四 影响盐析的因素 1 盐析用盐的选择 在相同离子强度下 盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异 一般的规律为 半径小的高价离子的盐析作用较强 半径大的低价离子作用较弱 柠檬酸 PO43 SO42 CH3COO Cl

6、NO3 SCN NH4 K Na 高价阳离子阴离子的影响大于阳离子 盐析中常用的盐 硫酸铵 硫酸钠 磷酸钾 磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 1 价廉 2 溶解度大 3 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好 4 不易引起蛋白质变性 缺点 1 水解变酸 2 高pH释氨 腐蚀 3 残留产品有影响 由下表可以看到 硫铵在0 时的溶解度 远远高于其它盐类 几种盐在不同温度下的溶解度 克 100毫升水 0 20 80 100 NH4 2SO470 675 495 3103Na2SO44 918 943 342 2NaH2PO41 67 893 8101 1 加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积

7、的情况 速度不能太快 分批加入 搅拌需适中 2 加入饱和溶液法用于饱和度不高而原来溶液体积不大的情况 可防止局部过浓 但加量较多时 料液会被稀释 3 透析平衡法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性 盐析效果好 但程序烦琐 故多用于结晶 硫酸铵的加入有以下几种方法 一般说来 离子强度越大 蛋白质的溶解度越低 在进行分离的时候 一般从低离子强度到高离子强度顺次进行 每一组分被盐析出来后 经过过滤或冷冻离心收集 再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度 使另一种蛋白质组分盐析出来 组成相近的蛋白质 分子量越大 沉淀所需盐的量越少 蛋白质分子不对称性越大 也越易沉淀 2 盐浓度对盐析效果的影响 S s S 蛋白质的

8、溶解度 g L I 离子强度 I 1 2 mizi2mi 离子i的摩尔浓度 Zi 所带电荷 常数 图中截距Ks 盐析常数 图中直线斜率 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 和Ks的物理意义 代表截距 即当离子强度为零 也就是纯水中的假想溶解度的对数 与蛋白质种类 温度 pH值有关 与盐无关 Ks 盐析常数 代表图中直线的斜率 Ks与温度和pH无关 但和蛋白质与盐的种类有关 但这种变化不大 用盐析法分离蛋白质的二种方法 第一类叫Ks分段盐析法 在一定pH和温度下通过改变离子强度实现 固定pH 温度 改变盐浓度 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感 易产生共沉淀现象 用于早期的粗提液 第二种叫

9、 分段盐析法 在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现 固定离子强度 改变pH及温度 由于溶质溶解度变化缓慢 且变化幅度小 因此分辨率更高 用于后期进一步分离纯化和结晶 盐析用盐量的确定 饱和度 Saturation 以硫酸铵为例 25 时 硫酸铵的饱和溶解度是767g L定义为100 饱和度 对多数蛋白质 当达到85 饱和度时 溶解度都小于0 1mg L 通常为兼顾收率与纯度 饱和度的操作范围在40 60 之间 原蛋白溶液体积为V 欲使其硫铵饱和度达到S 需加入饱和硫酸铵溶液的体积数 X V S 1 S X 应加入的饱和硫铵溶液的体积V 原蛋白质的溶液的体积S 应达到的硫铵饱和度 原蛋白溶液

10、饱和度为S1 现饱和度增加为S2 需加入多少饱和硫酸铵溶液 X V S2 S1 1 S2 X 应加入的饱和硫铵体积V 原有溶液的体积S1 原溶液硫铵的饱和度S2 要达到的硫铵的饱和度 加固体硫铵的方法 加饱和硫铵溶液会使溶液体积增大或使蛋白质浓度降低 因此加入固体硫铵比较适合 在20 时使1LM1摩尔浓度时 NH4 2SO4溶液增至M2摩尔浓度 所需加入 NH4 2SO4的克数C C 533 M2 M1 4 05 0 3M2 C 需加硫铵的g数M1 原溶液的浓度摩尔数M2 需达到的浓度摩尔数 在20 时使1LS1饱和度时 NH4 2SO4溶液增至S2饱和度 所需加入 NH4 2SO4的克数 C

11、 533 S2 S1 100 0 3S2 C 需加硫铵的g数S1 原溶液的饱和度S2 需达到的饱和度 以上数据都可在有关书上查到 上清液蛋白浓度 由于不同的蛋白质溶解度不同 沉淀时所需的离子强度也不相同 如果需要先除去些杂蛋白 然后在较高的饱和度下 沉淀目标蛋白质 则可采用分段盐析改变盐的浓度 可将混合液中的蛋白质分批盐析分开 分段盐析 fractionalsaltingout 在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵 当饱和度达35 时 尿素酶基本上仍留在溶液中 而饱和度达55 时 尿素酶几乎全都沉淀出来 3 pH值 一般来说 蛋白质所带净电荷越多溶解度越大 净电荷越少溶解度越小 在等电点时蛋白质溶解

12、度最小 为提高盐析效率 多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处 在进行盐析时 必须控制pH图中直线都相互平行 4 温度的影响 在低离子强度或纯水中 蛋白质溶解度随温度增加而增加 但在高浓度下 溶解度随温度上升而下降 在一般情况下 蛋白质对盐析温度无特殊要求 可在室温下进行 只有某些对温度比较敏感的酶要求在0 4 进行 随温度升高减小 热促失水膜Ks不随温度而变 5 蛋白质浓度 沉淀蛋白质盐的浓度范围并不固定 而和起始浓度有关 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量 若蛋白浓度过高 会发生严重共沉淀作用 除杂蛋白的效果会明显下降 在低浓度蛋白质溶液中盐析 所用的盐量较多 共沉淀作用比较少 但回收率会降低

13、分步分离提纯时 宁可选择稀一些的蛋白质溶液 多加一点中性盐 使共沉淀作用减至最低限度 一般认为2 5 3 0 的蛋白质浓度比较适中 相当于25mg mL 30mg mL 起始浓度30g L的COMb 大部分蛋白质在58 65 饱和度沉淀 稀释10倍的COMb溶液 饱和度达到66 才开始沉淀 而相应的沉淀范围为66 73 饱和度 五 盐析注意事项 选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度 稳定pH用磷酸缓冲液加盐缓慢均匀 搅拌缓慢 以免局部浓度过高 致酶失活 盐析后最好缓慢搅拌1h 再在冰浴中放置一段时间 为了避免盐对酶的影响 一般脱盐处理后再测酶活性 盐析蛋白尽快脱盐处

14、理 以免变性 透析慢 用超滤 盐析注意事项 硫酸铵的使用 硫酸铵中含有少量的重金属离子 对巯基敏感 H2S处理高浓度的硫酸铵呈酸性 pH 5 0左右 用氨水调pH 硫酸铵容易吸潮 计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中 盐析后一般放置0 5 1h后过滤或离心 过滤多用于高浓度硫酸铵溶液 离心多用于较低浓度硫酸铵溶液 六 盐析法特点 成本低 不需要特别昂贵的设备 操作简单 安全 不会引起蛋白质变性 经透析去盐后 能得到保持生物活性的纯化蛋白质 分离效果不理想 通常只是作为初步的分离纯化 还需要结合其它的纯化方法 第三节等电点沉淀法Isoelectricpoi

15、ntprecipitation 蛋白质属于两性电解质 溶液pH值高 蛋白质带负电 pH值低 带正电 当溶液的pH值为某一值时 蛋白质几乎不带电 即净电荷为零 这时的pH值为等电点 常用pI表示 两性电解质在溶液中pH处于等电点pI时 分子表面静电荷为零 导致赖以稳定的双电层及水化膜削弱或破坏 分子间引力增加 溶解度降低并沉淀析出 一 等电点沉淀的原理 不同的两性电解质具有不同的等电点 以此为基础可进行分离 pH pI 等电点沉淀法操作十分简便 试剂消耗少 给体系引入的外来物 杂质 也少 是一种常用的分离纯化方法 收率低 等电点附近 处 仍有一定的溶解度 有时甚至比较大 沉淀不完全 等电点沉淀法

16、往往不能获得高的回收率 很少单独使用 与盐析 有机溶剂沉淀等结合使用 二 等电点沉淀的特点 分辨率较低 许多分子的等电点比较接近 容易共沉淀 分辨率较低 主要用于去杂蛋白 最大缺点 无机酸有引起较大的蛋白质不可逆变性的危险 三 等电点沉淀注意事项 1 生物高分子的等电点易受盐离子的影响发生变化 由于无机离子的影响 蛋白质的等电点通常会发生 漂移 阳 高 阴 低 2 目的物的稳定性 有些蛋白质或酶在等电点附近不稳定 如 糜蛋白酶 pI 8 1 8 6 胰蛋白酶 pI 10 1 它们在中性或偏碱的环境中由于自身或其他蛋白水解酶的作用而部分降解失活 3 生物大分子在等电点附近盐溶作用很明显 单独使用或与溶剂沉淀法合用 控制离子强度 第四节有机溶剂沉淀法organicsoventprecipitation 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂 降低溶质的溶解度 使其沉淀析出 有机溶剂对于许多蛋白质 酶 核酸 多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用 是较早使用的沉淀方法之一 一 有机溶剂沉淀法的概念 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇 丙酮 甲醇和乙腈 常用于低盐浓度下沉淀蛋白质 pH4 8时