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1、Dionex液相色谱用户培训张丽娟2011年液相色谱基础知识部分液相色谱简介液相色谱理论基础2 Proprietary & Confidential高效液相色谱简介3 Proprietary & Confidential色谱的发明人俄国科学家：M. S. Tswett正式命名“色谱”的文献“”4 Proprietary & Confidential经典液相色谱iRev ewStop石油醚石油醚淋洗剂叶绿素叶绿素中的有叶绿素中的有色物质碳酸钙碳酸钙颗粒5 Proprietary & Confidential色谱法简介色谱法（Chromatography）溯源俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理
2、开创了应用吸附原理分离，植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献）色谱法；Chromatography 50年代开始广泛研究和应用主要是气相色谱及薄层色谱高效液相色谱法的广泛应用始于70年代6 Proprietary & Confidential什么是高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法简称HPLC，：是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段：种区别于经典液相色谱：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器在技术，理论及应用上处于迅速发展阶段7 Proprietary &
3、Confidential应用领域食品、饮料化工生物技术、医药环境应用领域应用领域8 Proprietary & Confidential8HPLC技术的发展趋势高速化、高效化高精度的高压泵、能走梯度洗脱；高灵敏度的检测器、紫外/可见光检测器,二极管阵列检测器（DAD）、（），荧光检测器，电喷雾检测器（CAD）以及示差、蒸发光散射检测器等。微粒硅胶为LC发展奠定了基础现在的填料粒度大多为10m 5，、 m 甚至3 m、亚2 m ，填料的微粒化产生了快速柱，微粒柱提高了分离效率和分析速度。键合相填料的出现拓宽了LC在多领域的实用能力。微径柱，毛细管柱，Nano柱提高灵敏度和分离效率特种柱专用柱增强
4、了色谱分离的选择性，9 Proprietary & ConfidentialHPLC技术的发展趋势自动化、智能化由色谱工作站单点控制泵、自动进样器、检测器的操作程序并作色谱数据处理和光谱信息处理，从而实现24小时无人操作。二极管阵列检测器的作用可在色谱分析的同时作光谱确认 HPLC与质谱仪的联用技术10 Proprietary & Confidential液相色谱系统：总体设计泵（含脱气机）自动进样器色谱柱（放于柱温箱中）检测器系统控制软件（电脑）控制软件泵泵自动进样器色谱柱检测器11 Proprietary & Confidential11泵泵自动进样器色谱柱检测器UltiMate 3000
5、仪器配置脱气机和溶剂架梯度泵带温控选项的自动进样器独特的柱温箱可放置两个柱切换阀可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器紫外可见光检测器12 Proprietary & Confidential高效液相色谱基础理论13 Proprietary & Confidential色谱分离过程流动相流动方向色谱分离过程流动相色谱柱固定相色谱分离过程固定相根据不同的相互作用原理和强度保留分析物由于不同化合物与固定相和流动相之间的相互作用强度和机理不同，所以当化合物流经色谱柱时就会被分分开。14 Proprietary & Confidential谱柱时就会被分分开14液相色谱图简介600 140,01 - P
6、arabene_Summit_0710 Parabene isocratic 70B Sum UV_VIS_2 - Parabene_Summit_0710 Parabene isocratic 70B Sum Pump_PressmAU bar363,573保留时间检测器信号400500130,01 - 5,2 - 68,863检测器信号峰高300120,03 - 84 - 12,930压力信号及波动100200100 0110,0%D:00%峰面积00 10 20 30 40 0 60 0 80 90 10 0 11 0 12 0 13 0 14 0 10-50 90,0,min12Flo
7、w: 0,50 ml/minMethanol: 70,0 %C: 0,0 %D: 0,0 %基线0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5, 6,0 7, 8,0 9,0 , , , , , 15,0色谱图：即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。15 Proprietary & Confidential15标为信号强度标为保留时间基础理论：术语介绍色谱峰Peak色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线峰底Peak Base峰的起点与终点之间连接的直线峰高Peak Height峰最大值到峰底的距离峰宽Peak Width在峰两侧
8、拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半（高）峰宽Peak Width at Half Height半（高） at Half Height通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离16 Proprietary & Confidential基础理论：术语介绍峰面积Peak Area峰与峰底之间的面积又称响应值 ,标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半半拖尾峰Tailing Peak后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰Leading Peak前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰Ghost Peak Peak并非由试样所产生的峰；亦称假峰17 Propri
9、etary & Confidential基础理论：术语介绍基线Baseline在正常操作条件下仅由流动相所产生的响应信号的曲线，基线飘移Baseline Drift Drift基线随时间定向的缓慢变化基线噪声；N Baseline Noise由各种因素所引起的基线波动谱带扩展Band Broadening由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象18 Proprietary & Confidential基础理论：术语介绍死时间，t0 Dead time不被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所需的时间，保留时间，tR Retention time组分从进样
10、到出现峰最大值所需的时间调整保留时间，tR Adjust retention time保留时间减去死时间死体积，V0 Dead volume不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积保留体积VR Retention volume， volume组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积调整保留体积，VR Adjust retention volume，保留体积减去死体积19 Proprietary & Confidential不对称因子计算示意图EP/USP标准：峰高AIA标准：LWLW10%RWRW10%LW RW5%5%A= 0.951.05：正常峰A 1.05：拖尾峰色谱的
11、分离度分离度的公式：tR2112ttRRR=tR1SignalPeak 2)(212WW +SPeak 1R = 1.5：基线分离色谱峰的完全分离是每个色谱方法的目标Time, min1w221 Proprietary & Confidential一个色谱方法的目标。分离度方程选择因子 1141=kkNR+容量因子柱效 k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度22 Proprietary & Confidential22基础理论：塔板理论塔板模型假设色谱柱是由大量分离层构成的这些
12、分离层称之为理论，塔板这些塔板实际是不存在的，他们只固流动是一种假设用来帮助描述色谱柱里所发生的一切在这些塔板里面，固定相和流动相定相动相板面动之间存在着一种平衡分析物在这种平衡里面存在着一种平衡系数K，定义为：相，：K = C固定相/ C流动相随着K的增加，分析物从色谱柱中的流出时间就越长即分析物的在，色谱柱内的保留时间越长23 Proprietary & Confidential23塔板理论数与柱效的关系理论塔板数用来衡量色谱柱质量好坏理论塔板数(N)：理论塔板数越高，柱效越高或者whntration理论塔板高度(H)：理论塔板高度越大，柱效越低concen高柱效色谱柱比低柱效色谱柱在同一
13、保留时间峰更窄理论塔板数越高，柱效越高wh色谱柱长，time (length)HLN=理论塔板数24 Proprietary & Confidential24理论塔板高度理论塔板数(N)计算方法理论塔板数计算方法：222=tNRW 方法tan1654.5=wtwtNRhRWtan16切线法Wh 5.54半峰宽W393W416 4W 25 5525 Proprietary & Confidential容量因子对分离度的影响000tttttttkRR =流动相固定相t k值小组分流出快，接近死时间2025R分离度差 k值大15分离度好 k值更大保留时间更长510峰会展宽，损失灵敏度常用k值范围0246810minutes0t t, 2 1且 = 1.01 Rs= 1若将R提高到2，以达到基线分离方法1 增加N需要提高N 6400%（N = 640,000）方法2 提高需要提高 1%（ = 1.02）提高分离度最有效的方法就是更换不同固定相类型的色谱柱28 Proprietary & ConfidentialRs与N、K及的关系图示29 Proprietary & Confidential
