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1、 亚甲蓝病毒灭活血浆的质量控制 乌鲁木齐市血液中心质量管理科梅静2015 4 血浆病毒灭活的必要性 随着血液检测技术的进步和血液管理措施的完善 目前的HBsAg 抗 HCV 抗 HIV的检测在很大程度上降低了输血导致病毒传播的几率 但由于1病毒变异导致免疫反应性的改变 2免疫静默感染 3检测技术存在窗口期漏检的局限性 4检测病原体种类的局限 输血引起艾滋病病毒 HIV HCV HBV 的风险尚不能完全杜绝 不常见的病毒如人类T淋巴细胞白血病病毒 HTLV 西尼罗病毒 WNV EB病毒等在大多数国家均未被列入血液常规检测 现有的检测手段不能完全排除血浆中可能存在的未知病毒 血浆制品病毒去除方法
2、乙醇沉淀 深层过滤 离子交换色谱和亲和层析色谱 纳米膜过滤纳米膜过滤技术 单一的病毒灭活 去除方法虽然能较好的起到处理病毒效果 但是无法灭活和去除所有病毒 如细小病毒B19 VIR918 PARV4 SV40和PrPSc 主要在血浆蛋白分离工艺中应用 血浆病毒灭活方法 有机溶剂 去污剂 S D 法 热处理 蒸汽处理法 终端干热法 低pH孵放法 辛酸处理法 亚甲蓝病毒灭活的技术原理 亚甲蓝又名美蓝 分子量319185 是一种光敏剂 吩噻嗪类染料 其最大吸收峰为670nm 临床上常作为解毒剂 用于治疗亚硝酸盐中毒引起的高铁血红蛋白血症和氰化物中毒 亚甲蓝表面携带正电荷 与病毒核酸结合后可以嵌入DN
3、A RNA中 与病毒核酸带负电荷的G C碱基对相结合 在有光照的条件下 亚甲蓝分子吸收光能后可激发产生单态分子氧 这种单态分子氧通过修饰鸟嘌呤碱基而影响核酸 使其产生缺口 引起核酸链的断裂或导致碱基位点丢失 从而阻止其复制 达到灭活病毒的目的 与脂膜和蛋白质结合对核酸有较高的亲和性亚甲蓝为多靶点的光敏剂 光照射产生单线态氧和羟自由基引起广泛损伤亚甲蓝可与病毒的核酸与脂质包膜相结合 在可见光的作用下 可使病毒的核酸断裂 包膜破损 因而能杀灭包括艾滋病病毒 HIV 乙肝病毒 HBV 丙肝病毒 HCV 等的脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒 对亚甲兰光化学法病毒灭活有效性的研究显示 血浆中指示病毒的滴
4、度显著下降 血浆中的病毒含量下降了6个数量级 可能残留的病毒量低于百万分之一 达到了国际公认的血浆病毒灭活有效性指标 也符合卫生部关于血浆制品病毒灭活的有关规定 亚甲蓝病毒灭活的技术原理 美国AABB技术手册描述了病原体灭活血浆制品 介绍了欧盟开展的三种病毒灭活方法 其中包括亚甲蓝 核黄素和补骨脂素 但美国未开展 欧盟指南中描述了病原体灭活的FFP制品的质量要求 同时也介绍了三种方法 英国指南中明确描述了亚甲蓝处理和去除的FFP制品的质量要求 质量要求中对亚甲蓝残留量要求为 0 3umol L 与我们的国标一致 一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器 Depasse最早提出了 过滤器的应用 极大地简
5、化和改进了MB P法的操作 为MB P法由实验室走向临床迈出了重要一步 目前使用的一次性使用血浆病毒灭活输血过滤器主要由亚甲蓝添加元件 光照袋 过滤器 血浆储存袋和连接管路组成 是一种简便 实用的血浆灭活器材 亚甲蓝作为一种外来物质进入人体后 对人体的潜在影响尚不可知 若病毒灭活血浆中残留过多的亚甲蓝 还会造成血浆外观和色泽的明显改变 使病人输注时可能产生心理负担 在保证灭活所需的有效浓度下 要尽量减少其残留量 因而对病毒灭活血浆中的亚甲蓝残留量 率进行控制很有必要 选择合适的亚甲蓝含量的测定方法很重要 医用病毒灭活箱的应用 当前的医用病毒灭活箱是用于光照灭活时的专用设备 它集光源 温控 机械
6、摆动等装置于一身 可以根据需要设定照射强度 照射温度 照射时间和摆动频率等诸多条件 使用方便 光源选择 荧光灯 1 单位时间内照射所释放的热量较低 2 达到相同灭活效果的照射时间最短 3 波长接600 700nm 照射方式 有效光照强度范围在30000 40000lx 1 放置血袋的托盘为钢丝结构 有较大空隙 使血袋两面都可以接受照射 2 照射过程中托盘以60 2次 分钟的频率摆动 3 箱内面为镜面 可以将灯管直射的光源和镜面反射的光源从360度全方位地照射血浆 亚甲蓝病毒灭活血浆在我国开展近十年 各种关于病毒灭活对血浆主要成分影响情况的报道可归纳为 血浆经过MB P法灭活后 血浆总蛋白回收率
7、90 以上 但部分不稳定的凝血因子 和纤维蛋白原 Fg 的变化明显 因子的回收率一般在80 左右 血浆的免疫原性 各种电解质 酶的稳定性等的变化不明显 PH值也未受影响 亚甲蓝的浓度与血浆病毒的灭活效果有直接关系 只有达到一定的释放量才能起作用 但亚甲蓝若残留过多会影响血浆的外观色泽 且亚甲蓝存在致突变的可能性 因而必须对灭活前后亚甲蓝的含量进行测 血浆中亚甲蓝残留量的检测 固相萃取小柱将亚甲蓝从血浆中提取出 分光光度计检测 不能直接用分光光度计测定血浆中亚甲蓝的含量 因为血浆本身为复杂的混合物 含有多种蛋白 在亚甲蓝最大吸光波长处血浆蛋白亦有吸光 而且血浆蛋白个体差异很大 因此无法取得准确的
8、检测结果 要想准确检测血浆中亚甲蓝含量 必须排除干扰 既将亚甲蓝提取出来 再进行测定 亚甲蓝检测依据 血站技术操作规程 2012年版 14附录F血液质量控制检查方法 F 19亚甲蓝残留量 全血及成分血质量标准 GB18467 2012 5 16病毒灭活冰冻血浆质量标准 亚甲蓝残留量 0 30 mol L 16 血浆中亚甲蓝残留量的检测 所需实验仪器 试剂试验仪器 固相萃取富集装置及配套的固相萃取耗材 推荐使用WatersOasis产品 真空泵分光光度计试管离心机试剂 亚甲蓝标准品粉剂 甲醇 乙酸 蒸馏水其他耗材 容量瓶 移液器 试管等 亚甲蓝残留量的检测原理 固相萃取 分光光度法利用固相小柱内
9、吸附介质是一种大孔聚合物 对血浆中亚甲蓝具有很强的选择性吸附 可排除血浆蛋白 脂肪和其它杂质的干扰 当血浆标本通过小柱时 血浆中血浆中亚甲蓝被柱子中大孔聚合物吸附 最后用洗脱液洗脱液洗脱亚甲蓝 采用柱子提取血浆中残留亚甲蓝 用含1 醋酸的甲醇溶液调零 在653nm检测标准 质控 测定管 其吸光度与浓度呈正比 WatersOasis小柱特性 大孔聚合物 对化合物的保留强 是一种通用性的吸附剂 pH范围较宽1 14 30 甲醇清洗 可完全去除血浆中的蛋白 脂质和其它杂质 亚甲蓝在不同溶剂中 最大吸收峰不同 甲醇溶液为653nm 故本法选653nm为测试波长 可用1 乙酸的甲醇溶液 迅速将柱床顶的亚
10、甲蓝洗脱 亚甲蓝酸性染料 pH3 51 乙酸的甲醇溶液 19 主要检测设备 固相萃取富集装置 亚甲蓝残留量检测方法 使用WatersOasis小柱萃取血浆中的亚甲蓝 使用前的Waters小柱 1 用6ml甲醇活化Waters小柱2 加入6ml供试血浆 亚甲蓝残留量检测方法 将萃取出的亚甲蓝洗脱后进行比色 Waters小柱萃取出血浆中的亚甲蓝 3 萃取亚甲蓝4 用30 甲醇6mL清洗5 用含1 乙酸的甲醇溶液2ml洗脱6 洗脱液离心 3500rpm 10min 7 用含1 乙酸的甲醇溶液作试剂空白 在654 2nm波长处测定吸光度注 用同样的方法萃取检测标准品 成品试剂盒的组成 小柱R1 活化液
11、R2 清洗液R3 洗脱液亚甲蓝标准液 100 mol L 质控液 0 300 mol L 操作方法 详读说明书 按说明书操作 1 柱预处理取小柱三支表明测定 标准 质控 分别插入固相萃取装置过滤柱子中 加入3ml活化液活化小柱 2 加标准液 10 mol L 取血浆0 36ml 加100 mol L标准液0 04ml混匀 于标明标准的小柱内加0 3ml标准液3 加质控液 0 300 mol L 取血浆0 36ml 加质控液0 04ml混匀 于标明标准的小柱内加0 3ml质控液4 加样 于标明测定的小柱内加6 0ml血浆 5 清洗待血浆完全进入小柱后 用3ml清洗液清洗小柱 去血浆中的蛋白质 脂质和其他杂质 血浆中亚甲蓝被吸附于吸附剂上 6 洗脱换干净的试管 加2ml洗脱液洗脱小柱上的亚甲蓝 7 检测将洗脱液离心3000转 5分钟 取上清液于4040半自动生化分析仪检测洗脱液调零 654nm波长 分别测定标准管和测定管吸光度 计算 亚甲蓝 mol L 0 5 mol L 比色 亚甲蓝遇光易分解 萃取后需及时比色 留取标本 病毒灭活冰冻血浆置30 37 融化时间应小于6分钟 为使其尽快融化 应不断轻柔摇动血浆袋 不得急剧摇动血浆袋 以防止血浆中出现大量泡沫 注意事项 谢谢
