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1、 第三章植物器官和组织培养 植物器官和组织培养的基本程序植物营养器官培养植物繁殖器官培养植物组织培养 组织培养步骤图 1 准备阶段查阅相关文献 根据已成功培养的相近植物资料 结合实际制定出切实可行的培养方案 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基 并经高压灭菌或过滤除菌后备用 2 外植体的选择与消毒选择合适的部位作为外植体 采回后经过处理 然后进行消毒处理 将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块 或剥离出茎尖 挑出花药 接种到启动培养基上 3 启动培养接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养 促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织 或顶芽 腋芽直接萌发形成芽
2、 将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体 最后发育形成再生植株 4 增殖培养分化形成的芽 原球茎数量有限 采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接 当芽苗繁殖到一定数量后 再将一部分用于壮苗生根 另一部分保存或继续扩繁 进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测 5 生根培养刚形成的芽苗往往比较弱小 多数无根 此时可降低或不加细胞分裂素浓度 提高生长素浓度 促进芽苗生根 提高其健壮度 6 炼苗移栽选择生长健壮 有3 5条根的生根苗进行炼苗 移栽到疏松透气的基质中 注意保温 保湿 遮荫 当苗完全成活后 再移向大田 拟定培养方案 外植体预处理 外植体无菌接种 启动培养 分化出芽 胚状体或原
3、球茎 继代增殖培养 生根培养 炼苗移栽 成活供生产使用 植物组织培养的一般程序 培养基配制灭菌 第一节植物器官和组织培养的基本程序 无菌外植体的获得初代培养物的建立形态发生和植株再生培养产物的观察记载 无菌外植体的获得 一 茎尖 茎段 叶片的灭菌清水冲洗 吸干 0 1 0 2 氯化汞浸泡2 10min 70 酒精浸泡数秒 10 次氯酸钙浸泡10 20min或2 次氯酸钠浸泡15 30min 灭菌水冲洗3 5次 无菌滤纸吸干 分割 接种 二 根 块茎 鳞茎的灭菌生长在土中 灭菌困难 以受损伤 灭菌前仔细清洗 加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间 无菌外植体的获得 三 花蕾的灭菌未开放的花蕾中的花药为花被
4、包裹 处于无菌状态 采摘后可直接灭菌 70 酒精浸泡10 30s 0 1 0 2 氯化汞浸泡3 10min 或1 次氯酸钠浸泡10 20min 灭菌水冲洗3 5次 无菌滤纸吸干 分割 接种 四 果实和种子的灭菌表皮有茸毛或蜡质 需在灭菌剂中加入几滴土温 80 果实70 酒精浸泡数秒 0 1 0 2 氯化汞浸泡3 10min 或1 次氯酸钠浸泡10 20min 灭菌水冲洗3 5次 无菌滤纸吸干 分割 接种 初代培养物的建立 一 无菌环境培养基 接种器械 超净工作台 接种室环境 抗生素物质 去除侵入组织内部的病菌 见表 二 规范操作操作技术熟练 工作经验 操作者 进入超净工作台的物品表面 三 条件
5、合适培养基种类 激素种类和浓度 其他添加物 外植体来源 生长发育状态 培养条件 形态发生和植株再生 建立的无菌培养物在适宜的离体环境中 生长发育 形态发生 形成完整的小植株 离体材料的形态发生的途径 器官发生体细胞胚胎发生 形态发生和植株再生 器官发生 芽或芽原基起源于培养组织中比较表层的细胞 即外起源 根原基发生在组织较深处 即内起源 两者之间一般没有什么联系 呈现单向极性 胚状体发生 极大多数体细胞胚起源于单细胞 形成的胚状体具有双极性 在其发育的早期阶段 在方向相反的两端分化出茎端和根端 其维管组织与母体植物或外植体的维管组织通常没有联系 胚状体维管组织呈独立的Y形 外植体形态发生形成完
6、整植株的途径 一 外植体 愈伤组织 完整植株 具体又可分为三种 1 愈伤组织 同时长芽和根 植株 2 愈伤组织 茎 根 植株 3 愈伤组织 根 芽 植株 4 愈伤组织 体细胞胚 植株 二 外植体 胚状体 植株 可从以下几种培养物中产生 1 器官上发生 2 愈伤组织上发生 3 游离单细胞发生 4 小孢子发生 诱导胚状体比诱导芽数量多 速度快 结构完整 三 外植体 直接形成根与芽 植株 如茎尖培养 培养产物的观察与记载 一 愈伤组织诱导率 产生愈伤组织的外植体数 外植体总数 100 生长量 培养一段时间后愈伤组织干重或鲜重 接种时愈伤组织的干重或鲜重 二 胚状体胚状体诱导率 产生胚状体的外植体数
7、外植体总数 100 三 芽芽分化数 产生芽的外植体数 外植体总数 100 四 根发根率 发根芽数 培养芽数每个材料平均发根数 第二节植物营养器官培养 植物根段培养植物茎段培养植物叶培养 一 离体根的培养 植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培养的技术 一 根无性系的建立来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭菌处理后的切段 可以以两种方式进行培养 建立根的无性繁殖系 1 根的直接增殖1 根无性繁殖系的建立将种子进行表面消毒 在无菌条件下进行无菌萌发 待根伸长后从根尖一段切取长1 0cm的根尖 接种培养基中 这些根的培养生长很快 番茄根每天约生长10mm 几天后发育出侧根 待侧根生长约
8、一周后 即可切取侧根的根尖进行扩大培养 它们又迅速生长出侧根 又可切下进行培养 如此反复 就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系 2 培养条件 黑暗培养 温度为25 27 一 离体根的培养 3 培养基离体根培养所用的培养基很多 多为无机离子浓度低的White培养基 其他培养基如MS B5培养基等也可采用 但必须将其离子浓度稀释到2 3或1 2 一 离体根的培养 一 离体根的培养 4 培养方式离体根的培养方式有三种类型 第一种固体培养法 即将根尖接种在固体培养基上 根依靠培养基中的养分和生长物质而不断生长 第二种是液体培养法 把根尖接种在无琼脂的液体培养基中 经常振荡使根获得充足的氧气 第三
9、种是固体 液体培养法 就是把根基部插入固体琼脂培养基中 根尖浸在液体培养基中 根尖生长而根不断的伸长和分枝 2 根的间接增殖第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织 如胡杨的根段培养 可诱导形成白色愈伤组织 第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化 如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株 一 离体根的培养 胡萝卜根培养 二 离体根生长的营养要求1 无机成分要求培养基中有全部必要元素 因为它是离体生长所需要的 一般的为MS B5培养基 2 氮源氮源有铵态氮 硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等 其中以硝态氮的效果最好 加入含各种氨基酸的水解酪蛋白 能促进离体根的生长 一 离体根的培养 3 碳源以蔗糖的效果
10、最佳 几乎为葡萄糖的10倍 蔗糖的浓度为2 3 4 维生素维生素以B1和B6最为重要 缺少它根的生长受到阻碍 而加入它可使根的生长成倍的加快 B1的使用浓度为0 1 1 0mg L为宜 5 生长物质对离体根的生长而言 生长素的效应最为明显 在一般情况 加入适量的生长素能促进根的生长 其反应和需要量因植物种而异 6 温度和光照黑暗有利于根的形成 温度一般在16 25 7 PH根发生和生长所需的PH范围一般为5 0 6 0 一 离体根的培养 二 茎段培养 茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体 包括块茎 球茎 鳞茎等在内的幼茎切段 的无菌培养 目的 1 快速繁殖 2 探讨茎细胞的分裂
11、潜力和全能性 以及诱发细胞变异 筛选突变体 我们主要是介绍用于快速繁殖为目的的茎段培养 茎段茎尖取材有限 可采用带节或不定牙的茎段进行培养 茎段培养用于快速繁殖的优点 培养技术简单易行 繁殖速度较快 每年可增殖105 1012株苗 加速良种和珍贵植物的繁殖 芽生芽方式增殖的苗木质量好 且无病 性状均一 解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题 且可节省种株 试管苗便于运输和防止种苗带菌传播 有利于国际种质交流 试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源 Murashige 1974 曾提出用组织培养法进行植物快速繁殖三个阶段的概念 第一阶段 外植体成苗 第二阶段 繁殖体增殖 第三阶段
12、 移植于土壤中长根 这三个阶段对于不同植物来说有不同的反应 应用于草本植物是成功的 但对木本植物来说 最大的困难是第三个阶段 1 无菌苗的建立 目的 从所取用的外植体诱发芽的形成 以获得无菌苗 可能有四种不同结果 一是得到单生芽 二是得到丛生芽 细胞分裂素水平高时三是得到长根的完整植株 四是得到愈伤组织 生长素水平较高时作为快速繁殖而言 我们希望属于第一 第二结果 它有利于提高繁殖系数 加速繁殖速度 2 无菌苗的增殖 增殖的途径一是诱导形成大量的胚状体二是诱导形成大量的不定芽三是促进腋芽的快速形成 2 无菌苗的增殖 优缺点 第一 二种途径的好处是增殖速度快 但会产生变异 第三种途径的好处是不会
13、产生变异 能保持品种优良特性 且方法简便 可在各种植物上使用 但增殖速度不如前二者 若用于育种 以第一 第二种途径有利 而用于良种快速增殖 以第三种途径有利 主要是要保证良种的优良品性 不产生变异 目前已广泛采用 每年每个芽可增殖10万株乃至上百万株 腋芽增殖的原理 高等植物的每个叶腋中都有腋芽存在 通常由于顶芽的存在 顶端优势阻止腋芽的生长 但在一定的条件下可以使它生长 如除去顶芽或使用生长激素 可以解除顶端优势 腋芽便不断分化和生长 逐渐形成芽丛 若反复切割这些腋芽和移植到新的培养基中继代培养 就可在短期内得到大量的芽 影响增殖成功的关键因素 A 细胞分裂素在腋芽增殖上的主要措施是用细胞分
14、裂素抑制顶端优势 促进腋芽生长发育 所以在这一阶段培养基中添加细胞分裂素是必须的 实践证实 除个别的例子外 加入细胞分裂素是行之有效的 6 BA对促进腋芽增殖是最有效 依次为KIN和2ip 一般浓度在0 25mg l以上 少数用1 0mg L 个别的用5mg L B 生长素生长素虽不能促进腋芽增殖 但可改善苗的生长 因此 许多种植物也都加入一定的生长素类物质 其中使用最多的是NAA 依次为IBA IAA和2 4 D 它们的使用浓度多为0 5mg L以下 影响成功的关键因素 C GAGA对芽的伸长有促进作用 故常加入少量的GA 使用浓度为0 5mg L D 光照光照条件也十分重要 这一阶段必须保
15、持适当的光周期 16小时光照 和光强 2000 3000Lux 以利芽的再生和生长 影响成功的关键因素 3 无菌苗的生根 这个阶段的目的是使再生的大量试管苗形成根系 获得完整的植株 在前两阶段以长苗为目的 使用的生长激素往往不利于生根的发生和生长 因此在这个阶段 必须创造一个适于根的发生和生长的条件 主要是降低或除去细胞分裂素 而加入或增加生长素 影响生根成功的关键因素 培养基的盐浓度试管苗的生根 对基本培养基的种类要求不严 一般的培养基都可用于诱导生根 但对其含盐浓度要适量加以稀释 前面的几种培养基中 除White培养基外 都富含N P K盐 它们都抑制根的发生 因此 应将它们降低到1 2
16、1 3或1 4 甚至更低的水平 就可得到理想的生根结果 生长素的浓度细胞分裂素同生长素的比值大于1时 有利于芽的产生和生长 比值小于1时 则有利于根的产生和生长 由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素 其苗中尚保持着一定的量 因此在生根培养时一般不需要添加细胞分裂素 或者仍使用较低浓度的细胞分裂素 如降低到0 02mg L以下 生长素是必须的 且需要较高的浓度 使用的生长素类物质最多的是NAA 依次为IBA IAA 2 4 D 生长素的浓度 NAA一般是0 1 1 0mg l不等 IBA和IAA可稍高些 光照和温度条件增强光照有利于发根 且对成功地移栽到盆钵中有良好作用 故在生根培养时应增加光照时间和光照强度 但强光直接照射根部会抑制根的生长 所以在生根培养基时最好在培养基中加入0 3 的活性碳 可促进生长 4 试管苗的移植 1 盆土的准备土最好是经过干热灭菌 高温高压灭菌 或者用福尔马林 5 或 0 3 硫酸铜稀释液喷洒在土壤中 然后用塑料布覆盖一周 在翻动土 让其溶液气味挥发掉 为了有利于试管苗根系的发育 要求移栽土疏松 因此与1 2 1 3的草木灰混合起来作为移植的介质 也可以
