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1、病理学技术概论及常规病理技术 课程简介 内容 着重介绍重要的病理学技术及其应用目的 提供病理学研究所需的基本技术知识体系和病理学研究的一些基本思路 课程结构 常规病理学技术细胞病理学技术及其在肿瘤病理学中的应用电镜技术及其在病理学中的应用定量病理学技术及其在病理学中的应用 基本要求 基本概念基本原理基本方法和技术关键联系实际 思考应用 一 病理学技术概念范畴 1病理学2病理学技术广义概念狭义概念 围绕病理形态学 病理形态学技术类型 尸体剖验技术 常规组织病理学技术 常规细胞病理学技术 组织化学和细胞化学技术 免疫组织化学技术流式细胞技术 超微结构技术体视学技术 定量病理学技术图像分析技术分子病
2、理学技术激光共聚焦显微镜动物实验技术三维重建技术 细胞培养技术 一 尸体剖验技术 目的意义 查出病因和病变 明确诊断及死因解释临床症状和体征等临床现象及时发现和确诊新疾病 特别是传染病提供第一手科研材料 法律手续 死者家属签字临床医生签字单位签字 基本要求 研究生 参加病理解剖本科生 见习 二常规病理学技术 组织取材及固定技术包埋石蜡切片技术冰冻切片技术HE染色 标本的来源与收集1 临床活检2 尸体解剖3 实验动物注意事项1 检查申请单的姓名 标本的件数是否与之相符合 2 标本是否符合要求 一 取材 固定 标本的来源与收集1 临床活检2 尸体解剖3 实验动物注意事项1 检查申请单的姓名及标本件
3、数是否相符 2 标本是否符合要求 取材 切取病变组织或拟研究的组织及时 尽可能新鲜迅速固定 冷藏生理盐水 磷酸缓冲液等溶液刀要快 不要挤压组织注意研究目的培养定量对比观察临床诊断 固定 一 固定 用化学试剂保持尸体 器官 组织结构和细胞结构的固有形态结构的过程谓固定 所用的化学试剂谓固定剂或固定液 目的 防止自溶 腐败 保持良好结构原理 组织及细胞内蛋白凝固 或使有关成分沉淀 变性 成为不溶性物质 方法 浸泡灌注 局部灌注 全身灌注蒸汽熏蒸 固定时间 常规组织病理学 可长时间固定细胞病理学 可长时间固定细胞化学 不宜过长 约1小时为宜固定后处理 充分洗涤固定时间越长 洗涤时间也应相应增加 固定
4、注意事项 1 固定液有毒性 注意自身防护2 及时 尽可能新鲜3 超微结构观察 低温固定4 注意不同研究目的对固定液的特殊需要细胞化学超微结构细胞涂片巴氏染色5 固定液用量 足 必要时及时更换 6 固定时间7 固定后洗涤 常用固定液 甲醛溶液 4 甲醛 或10 福尔马林40 甲醛 福尔马林 Formeldehyde 用于无特要求的组织常规固定乙醇 EthylAlcohol 95 用于细胞病理学涂片常规固定 糖原固定乙醇乙醚混合固定液 95 95 乙醇 95 乙醚 1 1 用于细胞涂片巴氏染色 二 石蜡包埋制样 组织块脱水 逐级乙醇脱水透明 二甲苯浸蜡 65 C包埋 溶解蜡 人工脱水程序 适应于3
5、mm厚的组织块 1 30 酒精24h2 50 酒精24h3 70 酒精24h4 80 酒精24h5 90 酒精12h6 95 酒精4h7 95 酒精4h 8 100 酒精2h9 100 酒精2h10二甲苯40min11二甲苯40min12石蜡 软 1h13石蜡1h14石蜡1h 三 石蜡切片 四 HE染色 苏木素 伊红染色 1脱蜡 二甲苯 2水化 逐级乙醇水化 100 30 3染苏木素41 盐酸酒精分化返兰逐级乙醇脱水 30 或50 95 伊红染色 逐级乙醇脱水 95 100 二甲苯透明 封片 中性树胶 盖玻片 HE染色法程序 三 常规细胞病理学技术 细胞病理学 cytopathology 诊断
6、细胞学 diagnosticcytology 临床细胞学 clinicalcytology 该学科是利用身体器官组织正常或病变的离体细胞进行涂片 经显微镜观察 做出疾病诊断 特别是肿瘤良恶性诊断 细胞病理学方法简便易行 诊断准确 可靠 已成为癌症早期诊断的重要手段之一 可广泛应用于临床和大量人群防癌普查 三 常规细胞病理学技术 一 取材 涂片制备痰涂片 胸水 腹水及尿液制片 二 固定三 染色 巴氏染色 常用固定液 1 等量95 乙醇和乙醚混合液 2 氯仿酒精固定液 3 95 酒精固定液 4 福尔马林固定液细胞学研究 固定液选择要根据实验要求条件而定 如用细胞涂片作原位PCR 固定液要选用多聚甲
7、醛 巴氏染色步骤 1 标本95 酒精固定3 5分钟2 Harris苏木素液5 10分钟3 水 蒸馏水或自来水 漂洗2 3次4 1 盐酸水溶液 或1 盐酸酒精液 浸1 3次5 自来水浸洗1 2次6 自来水或稀碳酸锂 100ml蒸馏水中加碳酸锂饱和液1滴 涂片返蓝为止 7 依次置入70 80 95 酒精 各2分钟8 桔黄G6液 1分钟9 95 酒精 缸 各1分钟10 EA36液 5分钟11 95 酒精 各1分钟12 无水酒精 各1分钟13 二甲苯 各2分钟14 中性树胶盖片封固 四 组织化学和细胞化学技术 用化学反应原理 在切片上滴加某种化学试剂 使之与组织或细胞中的生物化学物质结合 再用显色剂使
8、之显色 达到定位 定性地显示组织或细胞中的某种物质成分 这种技术称为组织化学和细胞化学技术 其结果可用显微镜和电镜观察 结合定量病理学技术 还可对有关成分定量 应用 糖类 脂类 核酸 酶类 胶原纤维 弹力纤维 神经纤维 细胞膜 核膜结构 五 免疫组织化学技术 概念 免疫组织化学技术是指利用已知的抗体与组织中相应的抗原结合 并利用显色剂在原位将抗原物质显示出来原理 抗原 抗体 显色剂特点 在组织中原位显示某种特异性抗原常用显色剂种类 酶 金属粒子 同位素生物素 化学显色剂 DAB 结果观察 显微镜 透射电镜 六 超微结构的基本技术 超微结构是在高分辨条件下观察到的细胞膜 细胞核 核仁 核膜 各种
9、细胞器 微绒毛 纤毛 细胞连接结构及胶原纤维 弹力纤维等光镜水平观察不到的细微结构 一 透射电镜技术 1 取材 1 1mm32 固定 2 戊二醛2h1 锇酸1 2h3 脱水 逐级丙酮 环氧丙烷4 包埋及聚合 浸透 包埋 Epon812 聚合 硬化 时间5 超薄切片 超薄切片机6 染色 饱和醋酸铀 1 柠檬酸铅7 透射电镜观察 二 扫描电镜技术 1 取材 1 1mm32 固定 2 戊二醛2h1 锇酸1 2h3 脱水 逐级丙酮 环氧丙烷4 干燥 临界点干燥 醋酸异戊酯5 喷金 6 扫描电镜观察 七 定量病理学技术 体视学 Stereology 二维结构信息定量推论三维结构信息 研究内容 二维定量推
10、论三维的原理 方法及应用 图像分析原理和方法 生物体视学 BiologicalStereology 用体视学原理和方法研究生物组织的三维结构 并据生物组织的结构特点研究相应的体视学测试方法称为生物体视学 形态测量学 Morphometry 平面测量学 Planimetry 体视学 Stereology 形态结构要素计数 如核分裂计数显微分光光度术流式细胞术激光共聚焦显微图像分析图像分析 特点 给出量化结果提高结果表达的客观性和准确性 应用 诊断 预后分析 基础数据 三维结构定量分析 形态与机能有机结合 八 分子病理学技术 广义概念 狭义概念 将分子生物学方法与病理形态学技术相结合 从分子生物学
11、水平原位阐明病变的特点和规律谓分子病理学技术 原位PCR技术 原位杂交技术显微切割技术 九 其他病理学技术 细胞及组织培养技术 细胞及细胞器分离技术 显微切割技术 显微摄影技术 核仁组成区技术 荧光染色技术 核移植技术 酶组织化学技术 放射自显影技术 流式细胞技术 激光共聚焦扫描显微镜技术 附 常规病理学技术详解 一 标本的来源与收集 一 1 临床活检2 尸体解剖3 实验动物 二 1 检查申请单的姓名 标本的件数是否与之相符合 2 标本是否符合要求 二 标本的处理1 对送检物进行编号登记 以免混乱 2 小组织全部包埋 3 大块组织切取其中部分组织 如肿瘤和肿瘤边缘组织 剩余组织在病理报告发出后
12、约一个星期后处理 三 组织的固定将取好的组织放入固定液进行固定 活检组织的固定 由于受到时间的限制 不能过多的占用时间 最多只能占2小时 其它的组织可固定10 20小时 但最好不要超过24小时 因这个时间对以后的免疫组化的显示都有影响 四 固定的作用固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固 终止或减少外源性酶和内源性酶的反应 防止细胞自溶 以保持组织的固有形态和结构 更重要的是保存组织或细胞的抗原性 不但使抗原不致失活 还要使抗原不发生弥散 以免在免疫组化染色时产生过深的背景 五 固定的目的1 能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶2 能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等3 使组织硬化 便于切块4 对某些具
13、有传染性的标本 能防止其扩散5 保存组织细胞中固有的物质6 保存好大体标本7 可增强染色 六 固定时的注意事项1 组织块越新鲜越好2 组织块不宜过厚过大3 根据需要选择适当的固定液4 组织固定时间不宜过长 也不能太短5 固定液的量要充分 1 56 不应强行将组织装入较小的容器内7 特殊方法需要特殊的固定液 七 固定液的选择1 尽量选择对组织收缩少 渗透快的固定液2 选择较通用的固定液 既能做好HE的染色 又能做免疫组化标记3 特殊的病例选择特殊的固定液如 狂犬病 丙酮磷酸酶 丙酮糖原 无水酒精 八 固定液的分类 醛类 甲醛 戊二醛 多聚乙醛 丙稀醛等 氧化剂类 四氧化饿 奥酸 高锰酸钾 重鉻酸
14、钾等 蛋白变性类 醋酸 甲醇 乙醇等 其它 氯化汞 苦味酸等 九 固定液的使用 一 甲醛 formaldehyde 一般市售的含37 40 平时使用都把它看为100 它由甲醛气体饱和于水而成 比重为1 12 有一股刺鼻的气味 甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的 因为它能和多种不同的功能基团结合 如近来的抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后 要将它们显示出来 就必须应用温度高达92 以上的抗原修复液 才能将其交联的醛键打开 与后来的抗体结合 将其表达出来 甲醛的优点 1 收缩较小2 固定较为均匀 穿透力强3 能使组织硬化并富有弹性4 能保存脂肪及脂类物质5 成本较低 甲醛的缺点 1
15、 成分不纯 含少量的甲醇 影响酶反应2 含少量的甲酸 易产生色素3 不能固定尿酸和糖类物质4 易挥发 污染环境5 易产生醛基 封闭抗原 应用甲醛配成的固定液有 1 缓冲福尔马林固定液 neutralbufferedformaaldehyde NaH2PO4 H2O4gNa2HPO4 无水 65g蒸馏水900ml甲醛100ml 2 10 福尔马林固定液甲醛10ml自来水90ml3 10 福尔马林盐固定液甲醛10ml自来水90mlNaCl0 9g 4 Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液75ml甲醛25ml冰醋酸5ml 5 Zonker氏液氯化汞5g重铬酸钾2 5g硫酸钠1g水100ml注 该固定液
16、固定时间为16 24h 染色前应用碘酒除去汞盐的沉淀 否则会影响染色后切片的观察 二 酒精 alcohol 有无水酒精 99 8 和工业酒精 95 在病理技术方面 酒精是一种重要的试剂 它可配成不同的浓度来进行脱水 如 60 70 80 90 95 等 在切片染色前 用酒精来除去二甲苯 在染完色后则用其来脱水 应当注意的是 组织脱水时应根据组织的大小 器官或部位 取材的大小来确定脱水时间 一般认为浓度越低 脱水时间可以相对延长 如70 可用来长期保存标本 但如果在100 的酒精里时间就不能太长 否则组织易脆不利于切片 酒精可以与其它试剂混合 配成混合固定液 如AAF固定液 酒精的优点 1 可以保存糖原和尿酸结晶 2 能在任何比例的情况下与水混合 3 能溶解苯类物质 为染色法中的桥梁试剂 4 能脱去切片上的水份 5 可配成混合固定液 6 可作为保存标本的固定液 7 可用来消毒 洒精的缺点 1 可溶解脂类及脂肪物质 2 可沉淀白蛋白 球和核蛋白 3 渗透力不强 4 可脱去某些已着染切片的颜色 5 不作为单独的固定液 6 价格昂贵 病理组织切片的制作 一 石蜡切片 一 组织脱水人体或各种动物
