《antagomir 转染方法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《antagomir 转染方法.doc（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、骨代谢研究室标准操作规程Antagomir/agomir转染细胞 姓名 陈志浩 时间（2016年02月17日修订）【原理】Antagomir是根据microRNA成熟体序设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。Agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小RNA,通过模拟内源性的miRNA来调节靶基因的生物学功能。【实验材料】Lipofectamin 2000: Invitrogen，cat：11668-030Antagomir/agomir细胞培养板【实验步骤】（24孔板为例）(1) 转染前一天，4-5104细胞接种在24孔板上， 0.5m
2、L含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。(2) 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。(3) 在50l的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol Antagomir/agomir (或0.8g DNA)，柔和混匀；(4) 混匀lipofectamin试剂，用50l无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1l lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1l lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2ll
3、ipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；(5) 将稀释好的Antagomir/agomir和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成Antagomir /lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。 (6) 将100l Antagomir/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。(7) 细胞在CO2培养箱中37温育6h后，除去复合物，更换培养基。48h后进行转染后的其它检测步骤。【注意事项】（1） 细胞培养板规格转染量如下参考下列标准：细胞
4、培养用品 表面积（mm2/孔） 细胞密度 培养基（L /孔） Lipofectamin2000(siRNA/DNA)96孔板 501.5104-5.0104 100L0.25l/0.5l24孔板 2008.0104-2.0105 500L1l /2l12孔板 4011.6105-4.0105 1.0 mL2l /4l6孔板 9623.0105-8.0105 2.0 mL5l /10l35 mm9623.0105-8.0105 2.0 mL5l /10l60 mm28271.0106-2.5106 6.0 mL10l /20l（2） 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。Antagomir/agomir (DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。
