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1、王立安：电泳技术原理一、概 述电泳：指带电胶粒或大分子在外加电场中，向着与其电荷相反的电极做定向移动的现（electrophoresis EP）。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所处介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 1808年Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法（moving boundary EP），将血清蛋白分为了5个组分，并于19
2、48年荣获诺贝尔奖。20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。长期以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以期实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。目
3、前，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。1. 电荷来源物质带电是一普遍现象。任何物质由于其自身的解离作用或表面上吸附其他带电质点均表现带电。两性电解质的带电与pI有关。如氨基酸、蛋白质、核酸。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。后来出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳，减少了扩散和对流等干扰作用。2. 支持介质最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳
4、进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷
5、和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。电泳槽 根据电泳种
6、类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽 Tiselius设计的自由界面电泳槽，是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。但90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。(2)管状电泳槽 50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱
7、状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。(3)板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中
8、蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm ，厚度为1mm2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以，电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。附属设备随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、
9、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、制胶板、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。4. 影响电泳速度的外界因素待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度。强度越高，泳动越快。多用常压（100-500V，2-10V/cm）。溶液pH：要求恒定，所以用缓冲液作电极缓液，决定带电颗粒的解离程度；与pI有关。溶液的离子强度：缓液离子强度越高，电动势越小，
10、颗粒泳动速度越慢；反之，则越快。最适值在0.02-0.2之间。电渗现象：液体在电场中，对一个固定支持物的相对移动。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
11、电渗现象是电泳的干扰因素，可选中性支持物克服。影响因素支持物：要求均匀、吸附力小，否则会造成电场强度不均匀，影响区带分离，结果重复性差。支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。温度：要求恒定。通过控制电压或电流、冷却散热解决。二、电泳分类1、按分离原理分为：区带电泳：电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲体系中分离成独立的区带，目前应用最广。移界电泳：Tiselius建立，在U形管中进行，目前已不用。等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦：据不同pI 的两性电解质在电场中，自
12、动形成pH梯度，使被分离物按各自pI 聚集成很窄的区带，分辨率较高。2、按有无固定支持物分类自由电泳，包括：显微电泳（细胞电泳），显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；移界电泳；柱电泳（在层析柱中进行）自由流动幕电泳；等速电泳等。持物电泳，应用最多。无阻滞支持物，如滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素粉、淀粉、玻璃粉凝胶颗粒等。高密度凝胶，如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳1、基本原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂（TEMED）和催化剂（AP）的作用下聚合、交联成三维网状结构的凝胶，以此胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰
13、胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。PAGE的历史1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。聚丙烯酰胺凝胶的优点凝胶透明，有弹性
14、，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH制和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，样品重复性好。样品不易扩散，且用量少，灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可调。分辨率高，尤其在不连续电泳体系中，即浓缩、分子筛和电荷效应为一体。应用广泛。可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量制备，还可测定分子量、pI等。连续与不连续凝胶电泳连续凝胶电泳：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应。不连续凝胶电泳：电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其
15、分离条带清晰度及分辨率都较前者佳，应用较广。2、不连续凝胶体系为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此，当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。 不连续凝胶体系中离子运动最广泛使用的不连续缓冲系统是由Ornstein和Davis（1964）设计的。样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH 6.8)，上下槽缓液为Tris-甘氨酸 (pH 8.3)，分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)，系统所有组分中都含0.1% SDS。样品和和浓缩胶中的Cl-形成移动界面的先导界面，甘氨酸 组成尾随界面，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前积聚。此处pH较高，甘氨酸被离子化后穿过被堆集的蛋白质并紧随Cl-之后，沿分离胶移动。从移动界面解脱后的蛋白质-SDS复合物形成一电位和pH均匀的区带涌动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小分开。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质样品中加入SDS和巯基乙醇后，蛋白质分子在巯基乙醇的作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS- 蛋白复合物，他
