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1、EV71病毒C4亚型重组病毒样颗粒诱导的中和抗体抑制吸附前及吸附后的感染 研究生 王新刚导师 孟继鸿教授 1 2 前言 EV71是小RNA病毒家族中的肠道病毒属 拥有大约7 4kb的单正链RNA 正二十面体衣壳 病毒基因组非结构基因P2和P3区结构基因P1区VP1 VP0 VP3 VP2和VP4 病毒蛋白酶3CD 空病毒衣壳 3 EV71是手足口病的病原体 手足口病发生于5岁以内的儿童 过去几年里 在远东地区如 中国 越南 韩国呈暴发流行 引起严重的发病率和死亡率 感染EV71的个体常常显示轻微的症状 如在手 足及背臀部的水泡和发烧 一部分EV71感染者发展成严重的神经系统并发症 包括小儿麻痹
2、症样瘫痪 脑干脑炎和肺水肿 最后导致死亡 4 没有特异的疫苗能够用于阻止EV71的感染 EV71分为三个基因型 A BandC 进一步分为11个基因亚型 A B1 B5 andC1 C5 因此 理想的EV71疫苗能够阻止大部分基因型感染 在所有研究EV71的疫苗中 病毒样颗粒 VLP 是最有前途的疫苗 在产量和安全方面都优于灭活疫苗 5 ChungYC HoMS等用重组EV71病毒C2亚型病毒样颗粒能够在小鼠和猕猴中诱导产生高滴度的抗体 用EV71VLP免疫的雌鼠能够通过被动免疫给予新生小鼠免受EV71致死性感染 证明中和抗体在免疫防御中起了重要作用 然而 抗VLP抗血清在体外如何中和EV71
3、病毒还不清楚 6 现在的研究是 用杆状病毒 昆虫细胞表达系统生产EV71病毒C4亚型的重组VLP 评价VLP在小鼠体内诱导中和抗体的能力 阐明抗VLP抗血清中和EV71的机制 7 材料与方法 一 细胞与病毒 实验中用的RD与Vero细胞 KuZ ShiJ LiuQ HuangZ 2012 Developmentofmurinemonoclonalantibodieswithpotentneutralizationeffectsonenterovirus71 EV71病毒C4亚型在RD细胞中增殖 根据Reed Muench的方法以TCID50在RD细胞上滴定其浓度 纯化 灭活的病毒有hualan
4、 中国河南 获得 8 二 衣壳亚单位蛋白特异性多克隆抗体抗 VP0豚鼠多抗抗 VP3多抗用与EV71有交叉反应的重组CAV16的VP3蛋白免疫豚鼠获得 用于检测EV71的VP3蛋白 抗 VP1多抗用大肠杆菌表达的重组EV71的VP1蛋白免疫兔子产生 9 三 载体构建从感染EV71病毒C4亚型的RD细胞抽提病毒RNA 随后用脱氧核酸引物和M MLV反转录酶进行反转录 用cDNA作模板 扩增编码P1与3CD基因片段 P1片段的扩增引物 forward5 AATCCATGGGTTCGCAGGTGTCT 3 andreverse5 GACAAGCTTTCAAAGAGTAGTGATCGC 3 用NcoI
5、andHindIII酶切 然后插入到质粒pIExBac 1 成为pIExBac P1 10 3CD片段的扩增引物 forward5 AATCCATGGGCCCGAGCCTTGATTTT 3 andreverse5 GACAAGCTTTCAAAATAACTCGAGCC 3 用NcoIandHindIII酶切 然后在同样位点插入到质粒pIExBac 1成为pIExBac 3CD 11 Figure1 Diagramsoftheconstructsusedinthisstudy lef2 theleftsequenceforhomologousrecombination hr5 Enh AcNPVh
6、r5enhancer IE1 P IE1immediateearlypromoter p10 P p10promoter IE1 T IE1terminator 1629 therightsequenceforhomologousrecombination 12 四 重组杆状病毒的产生 重组载体pIExBac P1和pIExBac 3CD 经过转染 产生 选择和重组病毒的增殖 分别产生相应的重组病毒 也就是IExBac P1和IExBac 3CD Sf9细胞用重组杆状病毒感染 感染后72小时 收集感染的细胞和上清 用于分析 13 五 用ELISA和WesternBlot分析表达的蛋白杆状病毒感
7、染的Sf9cells用Tris NaClbuffer12 000rpm离心5min获得蛋白溶解产物 一 间接ELISA 包被 5ul蛋白产物用50ulPBS稀释 包被96孔酶标板4 12h 用PBST 1 PBS 0 05 Tween20 洗涤三次 封闭 用5 牛奶PBST200ul 孔37 1h一抗 第一抗体 豚鼠anti VP0抗血清 兔anti VP1抗血清或者豚鼠anti VP3抗血清 用1 奶粉的PBST以1 1000稀释 以50ul 孔37 2h 14 二抗 标记的第二抗体 1 奶粉PBST以1 3000稀释 以50ul 孔37 1h 显色 TMB混合物以50ul 孔5 10min
8、 然后50ul 1NH3PO4终止 450nm测吸光度 二 Westernblotting 以12 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白然后转移至PVDF膜 用抗原特异一抗结合抗原 HRP 连接的第二抗体 用BeyoECLPluskit Beyotime Shanghai China 的化学发光试剂显示膜上的阳性标本 用LAS 4000冷光成像分析器记录 15 Figure2 CoexpressionofP1and3CDofEV71ininsectcells Lysatesfromthebaculovirus infectedSf9cellswereanalyzedbyELISAwith A anti VP
9、0 B anti VP1 or C anti VP3polyclonalantibodies 16 D byWesternblottingwiththeanti VP0polyclonalantibody Sf9 mock infectedSf9celllysate P1 lysatefromtheIExBac P1infectedcells 3CD lysatefromtheIExBac 3CDinfectedcells P1 3CD lysatefromcellsinfectedwithbothIExBac P1andIExBac 3CD ErrorbarsrepresentSE 17 六
10、 VLPs与对照抗原的制备ToevaluateVLPassembly theP1 3CDco infectedcelllysatewassubjectedtosucrosegradientsedimentation杆状病毒感染Sf9的溶解产物在20 的蔗糖缓冲液中以25 000rpm超速离心6h 合成的球状物用PBS重悬 然后分层于10 50 之上39 000rpm超速离心3h 从顶到底的片段用SDS PAGE户Westernblotting分析 富含VLP的层用PBS浓缩 透析 然后在20 蔗糖缓冲液中超速离心 VLPs用PBS重悬 然后用于动物免疫 用Westernblotting检测VP
11、0含量作为参考标准定量VLPs 未感染的Sf9溶解物如同纯化VLP一样处理 作为阴性对照抗原 用于免疫 18 Figure3 Sucrosegradientanalysis Lysateswerelayeredonto10 50 sucrosegradientsforultracentrifugation Tenfractionsweretakenfromtoptobottom A SDS PAGEanalysis ThetenfractionswereseparatedbySDS PAGE andsubsequentlystainedwithCoomassieBluedye M protei
12、nmarker EV purifiedwholevirionEV71standardfromHualanInc 19 B Westernblottingwithanti VP0polyclonalantibody C Westernblottingwithanti VP1polyclonalantibody D Westernblottingwithanti VP3polyclonalantibody 20 七 电子显微镜VLP样本用0 5 水样乙酸双氧铀负染 用PhilipsCM 12S放射电子显微镜观察 21 Figure4 ElectronmicroscopyofEV71VLPs Par
13、tiallypurifiedVLPswerenegativelystainedwith0 5 aqueousuranylacetateandvisualizedbytransmissionelectronmicroscopy Bar 50nm 22 八 VLP免疫小鼠诱导出抗EV71特异的抗体反应免疫之前 EV71VLPs与同样制备的阴性对照 Sf9 抗原与明矾 Pierce Rockford IL USA 根据厂商说明 以体积比1 1混合 混合物含有VLPs 相当于5mgVP0 或者Sf9阴性溶解产物 每组5只雌性Balb c小鼠 6 8weeksold 以0 2和5周次腹腔注射 每次免疫之
14、前 收集血清样本 在第七周老鼠被处死 血清保存在 80 备用 23 九 抗体测定 用间接ELISA测定血清样本中抗 EV71抗体的反应性 包被 灭活的EV71 10ng 孔 包被96 孔ELISA反应板37 3h 封闭 用5 奶粉PBST孵育37 1h 加血清 用1 奶粉PBST稀释血清样本37 2h 二抗 HRP连接抗小鼠IgG抗体37 1h 显色 显色 450nm测量OD值 24 Figure5 AntibodyresponsesfollowingVLPimmunization Groupsoffivemicewereinjectedi p atweeks0 2and5 withaluma
15、bsorbedantigens EV71 VLPequivalentto5mgVP0 orthecontrollysatesimilarlypreparedfromuninfectedSf9cells Theimmunizedmiceweresacrificedatweek7 2weeksafterthelastimmunization andtheserum bonemarrowandspleensampleswerecollectedandassayed Resultsarerepresentativeoftwoindependentexperiments A EV71 specifics
16、erumIgGtitersoftheSf9andtheVLPgroups Eachsymbolrepresentsamouse andthelineindicatesthegeometricmeanvalueofthegroup 25 十 斑点ELISA分析在最后免疫之后的第三周 收集三只免疫小鼠的脾脏和骨髓 做B细胞ELISPOT 分离脾细胞和骨髓细胞 浓缩 计数 96孔PVDF板 Millipore Billerica MA USA 用纯化灭活的EV71以100ng 孔预先包被 4 孵育过夜 PVDF板用完全RPMI1640培养基37 封闭2h 新鲜分离的脾细胞和骨髓细胞 1 105 孔 在5 CO2中37 孵育40h 用1 FBS和0 05 Tween 20的PBS缓冲液稀释生物素化的山羊抗 小鼠IgG 以0 1ug 孔加入到PVDF板中 37 2h 然后用PBS以1 1000稀释碱性磷酸酶链接的链霉亲和素37 1h 26 用水冲洗6次 加NBT BCIP酶底物100ul 孔孵育20min显色 用水冲洗终止显色 然后晾干 抗体分泌细胞的斑点用CTL免疫斑点器成像计数 27 Fig
