酶工程在食品工业中的应用ppt课件

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1、第四章酶工程原理及其在食品工业中的应用 1 第一节酶工程原理和方法 一 酶工程的定义利用酶 菌体细胞具有的特异催化功能 或对酶结构进行修饰改造 并借助于生物反应器和工艺优化过程 有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术 它包括酶 细胞固定化技术 酶化学修饰技术和酶反应器设计等 一 酶工程概述 2 酶工程一般工艺流程示意图 胞外酶胞内酶菌种 基因改造 发酵 发酵酶液 预处理 细胞分离 细胞破壁 碎片分离 提取 精制 酶制剂及其改造酶制剂 原料 前处理 杀菌 酶反应器 反应液 产品提取 成品 3 二 酶工程的发展历程1 20世纪50 60年代早期的酶工程技术 主要是从动物 植物和微生物原料中

2、提取 分离 纯化制造各种酶制剂 并将其应用于化工 食品和医药等工业领域 2 20世纪70年代后期 酶的固定化技术取得了突破 使固定化酶 固定化细胞 生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用 3 目前 各种酶工程技术已用于制造多种精细化工产品和医药产品 并且在食品工业 化学检测和环境保护等各个领域中得到了有效的应用 4 二 酶制剂的生产 1 包括菌种的来源 产酶菌种的分离 筛选 育种和酶的发酵生产等 2 酶生产菌的要求 1 不能是致病菌 特别是对食品用酶和医药用酶 目前认为可用于食品工业和医药工业的生产菌种有 枯草杆菌 黑曲霉 米曲霉 啤酒酵母和脆壁酵母 2 不易退化 不易感染噬菌体 3

3、产酶量高 而且最好产生胞外酶 4 能利用廉价的原料 发酵周期短 易培养 5 三 微生物细胞的破碎 胞外酶 能分泌透过细胞壁到细胞外部的酶 胞内酶 存在于细胞内部的酶 对于胞内酶的提取 需要破碎技术 胞外酶则无需破碎 破碎的目的是将细胞壁和细胞膜破坏掉 使胞内物质释放出来 包括机械破碎法和非机械破碎法 6 一 机械破碎法1 高压匀浆法适合于细菌和酵母的破碎 不适合于丝状真菌及某些基因工程菌 2 珠磨法适合于各种微生物细胞的破碎 3 超声破碎法对杆菌的破碎较容易 对酵母菌的破碎效果较差 7 二 非机械破碎法1 酶溶法加酶法 常用的有溶菌酶 蛋白酶 糖苷酶等 它们对细胞壁或细胞膜进行酶解 使细胞破碎

4、 自溶法 在微生物生长代谢过程中 控制一定条件 诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力 以达到细胞自溶的目的 2 化学渗透法用有机溶剂 变性剂 表面活性剂 抗生素或金属螯合物等处理 使细胞壁或膜的通透性 渗透性 改变 从而使胞内物质有选择地渗透出来 8 四 酶的提取与纯化 酶的提取 在一定条件下 用适当的溶剂处理含酶原料 使酶充分溶解到溶剂中的过程 也称作酶的抽提 即初步纯化 常用的方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取 酶的精制 即高度纯化 常用的方法 沉淀法 超滤法 色谱分离法 结晶法等 其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化 也可用于精制 9 一 根据酶分子溶解度不

5、同的方法通过改变某些条件 使溶液中某种物质的溶解度降低 从溶液中沉淀析出 达到与其他物质分离的目的 1 盐析沉淀法通常采用的盐有硫酸铵 硫酸钠 磷酸钾 硫酸镁 氯化钠和磷酸钠等 其中以硫酸铵最为常用 因为它在水中的溶解度大而温度系数小 不影响酶的活性 分离效果好 而且价廉易得 盐析沉淀所得到的产品常含有大量盐分 一般可用超滤或层析等方法脱盐 使酶进一步纯化 10 2 等电点沉淀法在酶的沉淀分离中 等电点沉淀法经常与盐析沉淀 有机溶剂沉淀和复合沉淀等方法一起使用 使其沉淀完全 3 有机溶剂沉淀法利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离 常用的有机溶剂有乙醇 丙酮 异丙酮 甲醇等 4 复合沉

6、淀法在酶液中加入某些高分子聚合物 例如 单宁 使它与酶形成复合物而沉淀下来 分离出沉淀后 再用适当方法将酶从复合物中重新析出 11 二 根据酶分子大小和形状不同的方法1 离心分离法在酶的提取分离纯化过程中 细胞的收集 细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离 12 2 体积排阻法利用具有一定大小网状的凝胶颗粒 固定相 填充柱的分子筛作用 利用溶液中各组分的相对分子质量不同来进行层析分离的一种方法 常用的凝胶有琼脂糖凝胶 Sepharose 聚丙烯酰胺凝胶 Biogel 和葡聚糖凝胶 Sephadex 等 13 14 3 透析透析膜可用动物膜 羊皮纸 火棉胶或塞璐玢等制成 使用时可做

7、成透析管 透析袋或透析槽等形式 优点 设备简单 操作简便 缺点 时间长 若不更换水或缓冲液时 只扩散到膜内外平衡为止 透析结束时 透析袋内的保留液体积较大 浓度较低 透析主要用于酶 蛋白质 核酸等生物大分子的分离纯化 从中除去小分子物质 透析在酶纯化过程中极为常用 通过透析可以除去酶液中的盐类 有机溶剂 低相对分子质量的抑制剂等 15 4 超滤借助于超滤膜将不同相对分子质量的物质分离的技术 是在一定的正压力或负压力驱动下 将料液强制通过一定孔径的超滤膜 部分小分子的溶质和溶剂透过膜而成为超滤液 而大分子的酶和蛋白质等物质被截留 从而达到分离纯化的目的 也可用于酶液的浓缩和脱色 超滤膜截留的颗粒

8、直径范围为2 200nm 相当于相对分子质量1000 500000 构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维 尼龙 聚砜 陶瓷等 16 三 根据酶分子电荷性质的方法1 离子交换层析根据被分离物质与分离介质 离子交换剂 间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的 不同离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同 而使不同物质分离 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和阴离子交换剂 酶具有两性性质 可用阳离子交换剂 也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化 17 2 电泳分离在外电场作用下 不同蛋白质离子所带净电荷的多少和性质不同 因而其向两极泳动的方向和速度也不相同 从而达到分离的目的 为了减少对流扩

9、散 电泳过程一般在浸透了缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶 淀粉胶等介质上进行 电泳分离的蛋白质量通常较小 约数毫克 常用作分析用 但现在已发展了制备电泳 用这种方法制备的酶 可以在介质中洗脱或直接从电泳柱底部依次流出 18 3 等电聚焦电泳先从阳极顶端扩散装入一种酸 如磷酸 然后从阴极端扩散装入一种碱 如乙醇胺 用具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作为两性电介质载体 当阴阳两极通电以后电介质在一定范围内便形成pH值梯度 当该载体电介质同样品一起电泳时 蛋白质便朝其各自等电点相等的pH值位置移动而被浓缩 优点 不但可将各种酶精确分开 通过测定各段的pH值还可以了解该酶的等电点 可以分离和检出等电点相

10、差仅0 02的两种蛋白质成分 19 四 根据酶分子专一性结合的分离方法1 亲和层析酶的底物 底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之间有着较高的亲和力 可作为配基固定于不溶性载体 可选择性地将酶吸附而同杂质分离 然后可以通过改变缓冲液的离子强度和pH值的方法 也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液 将酶洗脱下来 2 免疫吸附层析利用抗原一抗体的高亲和性反应原理进行酶的分离纯化 20 21 五 酶分离纯化的原则一般来说 根据溶解度变化的纯化方法较适宜于早期纯化阶段 规模较大 而柱层析法或电泳分离更适宜于后期的纯化过程 规模较小 硫酸铵沉淀法等纯化速度快一些 柱层析纯化速度慢一些 某些价

11、格昂贵的层析介质及方法 可只用于纯化过程的最后几步 22 六 酶的分离纯化应注意的问题1 要注意防止酶变性失活低温 不能过酸 过碱等 2 酶分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去 因此选择分离方法是应尽可能不破坏酶所需要的条件 3 通过检测酶活性 为选择适当方法和条件提供了直接依据 一个好的酶分离纯化的方法和措施是使酶的纯度提高倍数大 活力回收高 同时重复性好 23 七 酶的纯度与酶活力许多分离方法都可用于检验酶的纯度 实验室常用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检验酶的纯度 酶分子结构高度复杂 同一种酶制剂 采用不同方法检验结果可能不一致 酶的纯度应注明达到哪种纯度 如电泳纯 HPLC纯等 比活力

12、每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数 一般情况下 酶的比活力随酶的纯度的提高而提高 酶的纯度也可用酶的比活力来衡量 24 测定酶活力可采用中止反应法 连续反应法 或采用自动化酶分析仪操作进行 中止反应法 在恒温反应系统中进行酶促反应 间隔一定的时间 分几次取出一定容积的反应液 使酶停止作用 然后分析产物的生成量或底物的消耗量 几乎所有的酶都可根据这一原理 设计出测定其活力的具体方法 连续反应法 不需要取样中止反应 而是基于反应过程中光谱吸收 气体体积 酸碱度 温度 黏度等的变化 用仪器跟踪检测反应进行的过程 记录结果 算出酶活力 连续法使用方便 一个样品可多次测定 但很多酶反应不能用该法测定 自动化

13、酶分析仪 从加样 启动反应 检测 数据记录及结果处理等 整个过程均由仪器自动完成 25 六 酶的固定化 一 酶的固定化方法1 吸附法 1 物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法 吸附的载体 包括无机载体 活性炭 石英砂 多孔玻璃 氧化铝 硅胶 磷酸钙 和有机载体 淀粉 谷蛋白 纤维素 葡聚糖 琼脂糖 聚丙烯酰胺 等 优点 具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变化少 若能找到适当的载体 这是简单的好方法 缺点 酶与载体结合力弱 酶易脱落等 26 2 离子吸附法 通过离子效应 将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上 常见的载体 DEAE 纤维素 DEAE 葡聚糖凝胶 CM 纤维素 D

14、OWEX 50等 优点 操作简单 处理条件温和 能得到酶活回收率较高的固定化酶 缺点 酶与载体的结合力较弱 当离子强度高 缓冲液种类或pH值发生变化时 酶容易脱落 27 2 化学结合法 1 共价结合法 将载体有关基团活化 与酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法 是研究得最多的固定化方法之一 可与载体结合的酶的功能团 或 NH2 或 羧基 巯基 咪唑基 酚基等 但参与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基因 否则可能会导致固定后酶活力完全丧失 特点 反应条件苛刻 操作复杂 容易使酶的高级结构发生变化而破坏活性中心 操作时需注意 28 2 共价交联法 通过双功能或多功能试

15、剂 交联剂 在酶分子之间或酶分子与微生物细胞之间形成共价键的连接方法 它与共价结合法的区别是它使用交联剂而不用载体 常用的交联剂 戊二醛 异氰酸酯 顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物等 特点 反应条件比较激烈 固定化酶的活力回收率较低 但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间 会有助于固定化酶比活力的提高 29 3 包埋法可分为凝胶网格型和微囊型 将酶或微生物包埋在高分子凝胶网格中的包埋法称为凝胶网格包埋型 将其包埋在高分子半透膜中的包埋法称为微囊型 优点 一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应 较少改变酶的高级结构 酶活力的回收率较高 缺点 仅适用于小分子底物和产物的酶 因为只有小分子物质才能扩散进入高分

16、子凝胶的网格 并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低 30 1 凝胶网格型 采用明胶 卡拉胶 海藻酸钠或淀粉等天然高分子化合物作为包埋剂时 可以将酶直接与溶胶态的包埋剂混合凝胶化 缺点 凝胶孔径不规则 有一部分大于平均孔径 时间稍长时 酶容易泄漏 常与交联法结合达到加固的目的 如先用明胶包埋 再用戊二醛交联等 31 2 微囊型 利用各种类型的膜将酶封闭起来 这类膜能使小分子产物和底物通过 而酶和其他的高分子不能通过 缺点 反应条件要求高 制备成本高 32 33 二 细胞的固定化方法细胞固定化的主要方法有用载体对细胞的包埋法和利用载体与细胞之间吸引力的吸附法两种 固定化细胞的制备方法类似于固定化酶的制备方法 优点 固定化后酶活基本没有损失 它还保留了细胞原有的多酶系统 对于多步催化转换的反应 优势更加明显 而且勿需辅酶的产生 缺点 在选用固定化细胞作为催化剂时 应考虑到底物和产物是否容易通过细胞膜 膜内是否存在产物分解系统和其他副反应系统 或者说虽有这两种系统 但是否可事先用热处理或pH值调整等简单方法使之失效 34 三 固定化酶 细胞 的性质1 酶活力的变化酶经