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1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用 遗传标记 geneticmarker 具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁 性状标记色泽 形态 细胞学标记倒位 易位 G N C带 生化标记同功酶 分子标记RFLP RAPD SSR AFLP SNP 基础 基因表达结果表现型 DNA碱基序列变异 形态标记 遗传学上稳定 可见的外部特征 遗传与环境 结构基因与调控基因综合作用的结果 如穗形 芒长 穗长 粒色 穗形 矮秆 卷叶等 特点 直观简单从基因型到表现型存在基因表达 调控 个体发育等环节 表型差异有时难以反映基因型差异 细胞学标记 染色体数目变异及结构变异 表现在染色体核型 数目 大小 随体 着丝点位置等
2、 和带型 C带 N带 G带等 随着分带 细胞原位杂交等研究技术的发展 可在染色体水平揭示更多遗传变异 特点 直观 快速而经济 但变异十分有限 当染色体数目形态相似时难以分辨 生化标记 贮藏蛋白和同工酶 贮藏蛋白同工酶特点 经济 方便 成本较低结构基因表达产物 对非结构基因无能为力 所检测位点只是基因组一部分 数量有限 有时受发育时期和环境影响 分子标记 本质是以核苷酸序列作为标记 一般特点 1 不受季节 环境 基因表达与否的限制 2 多态性高 存在着丰富的等位变异 3 数量丰富 多态性遍及整个基因组 4 表现为 中性 不影响目标性状的表达 与不良性状无必然的连锁 5 许多分子标记表现共显性 能
3、鉴别纯合杂合基因型 提供完整的信息 分子标记的分类 Staub等1996 植物遗传研究中常用的分子标记 RFLP RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD RandomAmplifiedPolymorphicDNAs DAF AP PCR SSR SimpleSequenceRepeatAFLP AmplifiedFragmentLengthPolymorphism RFLP 原理 DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记 如地高辛等 的探针杂交胶片放射自显影 显示酶切片段大小 酶切 3 5ugDNA 以10U内切酶酶切5小时电
4、泳 0 6 0 8 琼脂糖胶70V电泳16小时染色 EtBr染色20分钟变性 0 25MHCl20分钟 抽真空 水冼印迹 加入0 4NNaOH 进行Southern印迹冲洗 以2 SSC冼胶 风干 酶切 电泳 印迹 杂交 洗脱 预杂交 将杂交膜放人预杂交液 水 5 HSB Denhardt 中 封好后置65 温箱中振荡5 6小时 杂交 预杂交液中加入标记好的marker和探针 放入杂交膜浸匀 封好杂交盒后 置65 温箱中振荡过夜 洗脱 将膜转入洗脱盒 加入洗脱液65 振荡洗脱两次 15min 次 吸干包好 放射自显影 将洗脱好的杂交膜置于增感屏上 于暗室中将X 光片放于杂交膜上 再放上另一张增
5、感屏 装人暗袋 并用夹板夹好 置 70 超低温冰箱中曝光10天左右 使用磷屏仪 操作更方便 RFLP探针 来源 cDNA探针与基因组DNA gDNA 探针cDNA探针 保守性较强 探针检测的多态性频率较低 gDNA探针 检测的多态性频率较高 但不同种属特异性较强 玉米RFLP探针 http www maizegdb org probes Html 探针标记 随机引物法 25ng变性DNA5ul寡聚核苷酸2ulBSA3ul 32P dCTP2ulKlenow酶加水至50ul 37 温箱中标记2小时 RFLP标记特点 共显性 可以区别纯合和杂合基因型稳定 重复性强某些植物中开发探针已遍及整个基因组
6、缺点 DNA需要量较大 技术复杂 用于做图较费时 难以分析大量样品 在基因组较大 严格自花授粉作物上多态性很低 使遗传图饱和度低 RAPD 原理 用一个随机引物 8 10bp 碱基随机排列的寡核苷酸序列 非定点地扩增基因组DNA 然后电泳分开扩增片段 PolymeraseChainReaction PCR 3 5 TCATGA CGAGCG DNAisdoubledwitheachcycle RAPD的操作 PCR反应 DNA 20ng l 1 lPrimer15ng10 Buffer2 0 lMg2 25mM 1 2 lTaq酶 5U l 0 15 ldNTP 25mM 0 2 l加水至20
7、 l 再加入石腊油 进行PCR扩增 Step195 2分钟Step295 15秒Step336 30秒Step472 45秒Step5GOTOStep246循环Step672 5分钟 PCR扩增 主要特点 无需杂交 设计引物也无须知道序列信息 DNA需要量少 引物便宜 成本较低 技术简便 操作方便 快速 不涉及分子杂交和放射性自显影等技术 不同物种间引物通用 缺点 大多显性遗传 不能鉴别杂合和纯合子 实验重复性较差 结果可靠性较低 DAF DNAamplificationfingerprinting 与RAPD不同的是 引物浓度更高 引物长度更短 一般5 8个碱基 且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、通常会产生非常复杂的带型 谱带信息比RAPDs大得多 Caetano Anolles等 1990 AP PCR arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction 引物较长 10 50bp 引物浓度较高 引物长度不定 并且常常来自为其它目的而设计的引物 如M13通用测序引物 ISSR 共同优点 在不需要知道所扩增DNA序列情况下 产生DNA片段的指纹 需DNA量少 产生多态性丰富 缺点 对反应条件非常敏感 重复性差 SCARs SequencedCharacterizedAmplifiedRegions 为提高RAPD标记稳定性 把目标RAPD片段克隆测序 根据片
9、段两末端的序列设计特定引物 通常24个碱基 再进行PCR扩增 可把相应的单一位点鉴定出来 具有更高的可重复性共显性 微卫星标记 SSR 真核生物基因组普遍存在 呈随机分布 大约每隔10 50kb就存在一个SSR 哺乳动物中约为植物的5 6倍 植物中平均23 3kb有一个SSR 双子叶植物SSR数量大于单子叶植物 核DNASSR数量多于细胞质DNA 根据核心序列碱基数的不同 可分为单碱基 2碱基 3碱基 4碱基等多种重复型 不同物种其重复序列及重复单位频率不同 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR 1 4bp 的搜索 发现 AT 最丰富 然后依次是 A n T n AG n
10、 CT n AAT n ATT n AAC n GTT n AGC n GCT n AAG n CTT n AATT n TTAA n AAAT n ATTT n及 AC n GT n 同一类内碱基种类不同的SSR 丰度差别很大 SSR的分布特点 SSR的功能 长期以来一直认为SSR是转录哑区 没有明确的生理功能 但随着研究深入 证明并非如此 SSR的主要功能 编码氨基酸 染色体末端的SSR 有保护DNA完整性 避免降解 融合及丢失的功能 提高或降低临近基因转录速率 基因重组的热点 是基因变异的来源 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体 两端序列多是保守的单拷贝序列 可以根据两端序列设计
11、一对特异引物 通过PCR将其间微卫星序列扩增出来 利用电泳技术获得长度多态性 不同材料重复次数的不同 导致了SSR长度的高度变异性 SSR分析 SSR分子标记的创制 基因组文库的构建探针制备 预杂交 带有SSR克隆的选择测序引物设计检测其它方法 EST SSR 相关种间SSR Cross speciesSSR TaxonomicTransferabilityPolymorphismDivergence N N Samesubgenus89 8 521 78 3 299 Samegenus76 4 1800 86 0 773 Samealliance45 4 403 50 4 141 Samef
12、amily35 2 1683 58 4 363 SSR的操作 PCR反应 DNA 20ng l 4 lPrimer 1mM 0 25 l10 Buffer2 0 lMg2 25mM 1 2 lTaq酶 5U l 0 1 ldNTP 25mM 0 2 l加水至20 l 混合后 进行PCR扩增 Step195 2分钟Step295 30秒Step356 30秒Step472 60秒Step5GOTOStep231循环注 SSR引物退火温度在52 65 不等 SSR的特点 两侧顺序保守 在同种间多相同 数量丰富 在整个基因组均匀随机分布 实验重复性好 结果可靠 多数SSR增减重复序列频率高 在品种间
13、具广泛位点变异 共显性标记 可鉴别杂合子和纯合子 仅需微量组织 适合PCR分析半自动化 相对的物种专一性 由于开发时需针对每个座位的微卫星序列 发现其两端的单拷贝序列设计引物 需建立基因文库 克隆识别与筛选 测序等过程 开发困难 费用较高 耗时长 实际分析时一般每次只分析单个位点 不同引物退火温度不同 需要探索 不足 SSR的检测 琼脂糖凝胶检测 同前 聚丙烯酰胺凝胶检测一般采用银染 荧光检测 银染检测程序 脱色 加1升10 HAC液 脱色20分钟冲洗 用重蒸水冲洗胶板2次 每次5分钟染色 加染色液 1 AgNO3 0 075 甲醛 30分钟冲洗 用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟 显影 预冷显影液
14、 30g LNaCO3 0 075 甲醛 0 4mg mlNa2SO3 轻摇到带纹出现 定影 在固定 停止液并轻摇3 5分钟 冲洗 用重蒸水冲洗2次 每次2分钟 干胶 室温下自然干燥过夜 AFLP AmplifiedFragmentLengthPolymorphism 原理 基于RFLP技术和PCR技术的结合 DNAMseI MseIMseI EcoRIEcoRI EcoRIMseI MseI片段环化 不利小片段扩增 EcoRI EcoRI引物的退火温度高 MseI EcoRI片段优先扩增 酶切连接 接头序列 Mse 接头 Pst 分别为 Mse 5 GACGATGAGTCCTGAG 3 3
15、TACTCAGGACTCAT 5 Pst 5 CTCGTAGACTGCGTACC 3 3 CTGACGCATGGTTAA 5 EcoR 5 CTCGTAGACTGCGTACC 3 3 CTGACGCATGGTTAA 5 M00 5 GATGAGTCCTGAGTAA 3 P00 5 GACTGCGTACCAATTC 3 E00 5 GACTGCGTACCAATTC 3 MseI primers 3 5 GATGAGTCCTGAGTAANNN 3 EcoRI primers 3 5 GACTGCGTACCAATTCNNN 3 PstI primers 3 5 GACTGCGTACATCGAGNNN
16、 3 AFLP技术的特点 1 由于内切酶及选择性碱基组合数和种类很多 产生标记数无限 可覆盖整个基因组 2 多态性远远超过其它分子标记 一般可检测到50 100个AFLP扩增产物 能够在遗传关系十分相近的材料产生多态性 被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术 3 AFLP分析由于扩增片段较短 30 700bp 分辨率高 4 AFLP分析用样量少 0 05 0 5 gDNA 而且对模板浓度的变化不敏感 5 由于特定引物扩增 退火温度高 因而假阳性低 可靠性高 6 引物在不同物种间是通用的 可用于没有任何分子生物学研究基础的物种 7 银染技术具有快速 方便的特点 在1 2天内可以得到指纹 AFLP操作具体包括三个步骤 1 酶切 连接 2 PCR扩增 使目的序列扩增到0 5 1 g 3 电泳分离 利用聚丙烯酰胺凝胶 对于基因组较大的物种 需要进行两步扩增 预扩增和选择性扩增 AFLP操作步骤 模板DNA的酶切与连接 DNA 200ng l 2 5 lMse 3单位Pst 3单位Mse 接头 50pmol l 1 0 lPst 接头 5pmol l 1 0 l10 NEBBuffer2
