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1、阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测 1 PNH paroxysmalnocturnalhemoglobinuria 是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病 但近年来有增多趋势 我国北方多于南方 半数以上发生在20 40岁青壮年 男性多于女性 与遗传及种族无关 本病起病隐袭缓慢 呈慢性过程 以贫血 出血为首发症状者较多 以血红蛋白尿起病者较少 2 3 血红蛋白尿 睡眠有关 早晨较重 下午较轻尿液外观为酱油或红葡萄酒样 伴乏力 胸骨后及腰腹疼痛 发热等 4 原因 因为补体作用最适宜的pH是6 8 7 O 而睡眠时呼吸中枢敏感性降低 酸性代谢产物积聚 5 6 研究历史 Strubing第一次报道P
2、NHHam和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下 易发生溶血 这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig a基因突变 7 流式细胞术 原理 X染色体上PIG A 造血干细胞经获得性体细胞基因 突变导致糖化肌醇磷脂 GPI 锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失 包括CD16 CD55 CD59等 8 9 GPI锚连接蛋白 补体调接蛋白衰变加速因子 DAF或CD55 膜攻击复合物抑制因子 MACIF或MIRL或CD59 补体C8结合蛋白 HRF或C8bp 膜辅助蛋白 MCP 粘附分子淋巴细胞功能相关抗原 3 LFA 3或CD
3、58 Blast 1 CD48 CD67 CD66 10 GPI锚连接蛋白 酶类红细胞乙酰胆碱脂酶 AchE 中性粒细胞碱性磷酶酸酶 NAP 5 外核酸酶 CD73 受体类中性粒细胞III型Fc受体 FcRIIIb或CD16 单核细胞分化抗原 CD14 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 u PAR 血型抗原CD55携带的Comer抗原 AchE携带的Yt抗原 11 1型细胞CD59完全阳性 12 补体激活途径 C1C1C2 C4C4b2b C3转化酶 C3C3bP 备解素 PC3bBbC3bB C5转化酶 C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b 9 MAC CD59
4、 替代途径 经典途径 CD55 Ag Ab 13 分析 1 红系及粒系FSC SSC设门报告标本中CD55 CD59阴性比例 14 做20 30份正常人血样划定阳性区 区 范围同型阴性对照界定 区范围 中间的区域即为 区 15 16 根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性正常细胞2型细胞CD59部分阳性补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞 17 18 19 20 CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现 单GPI缺失不能确诊 CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临
5、床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势 解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性 意义 21 其它细胞的PNH检测 PNH患者的红细胞 粒细胞 单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失 粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早 网织红细胞略早于红细胞 22 其它细胞的PNH检测 应用FSC SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞 这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了 这时必须使用系列标志 SSC设门 CD15 CD33 CD64设门 分析单核CD14 CD55 CD59 PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞
6、上GPI相关蛋白的表达来诊断 23 与其他实验比较 1 酸溶血试验 Ham试验 患者红细胞与含5 盐酸的正常同型血清混合 pH6 4 37 孵育2小时 溶血明显 本试验特异性高 敏感性差 2 蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径 使补体敏感的红细胞发生溶血 本试验特异性强 敏感性优于酸溶血试验 3 热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差 常作为筛选方法 24 具有PNH克隆的血液病 检测粒细胞GPI锚连蛋白表达病种检测例数缺失例数 AA11525 22 MDS399 23 并发现MDS有PNH表达者ATG 人胸腺细胞免疫球蛋白 治疗有效 AnInternMed1999 131 401 25
7、PNH和AA关系 相当密切 可以相互转化且并存AA PNH较多 15 PNH AA少20 30 PNH可伴骨髓再障AA ATG治疗后 PNH10 31 AA PNH综合征16 5 我国 50 AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AA PNH生存率要高于PNH AAMDS RA如捡出PNH克隆者预后好 且ATG 人胸腺细胞免疫球蛋白 治疗有效 PNH对AA和MDS的 自然治疗 而 AA救了PNH 26 PNH克隆见于淋巴增殖性疾病 检测病种例数NHL87HD55红细胞CD55 CD59CLL49缺失检出率9 2 ALL22HCL4 HematolJ2001 2 33 27 PNH克隆见于浆细胞病 检
8、测红细胞CD55 CD59缺失病种检测例数缺失例数 MM626WM72MGUS61HCD21合计7710 12 9 IntJHematol2002 75 40 28 FLAER 嗜水气单胞菌溶素变异体 FLAER 1998年Diep等报道嗜水气单胞菌 HEC 毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合 随后立即聚合成多具体 插入细胞膜脂质双层 在膜上形成孔洞致溶破 PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好 29 FLAER FLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达 所以正常人及非PNH贫血FLAER成100 阳性 是目前诊断PNH最敏感 特异的方法 FLAER对PNH克隆
9、检出的敏感性为0 1 其它靶向标记检出率的敏感性为1 30 结果分析 1 设门CD45 SSC2 标记CD15 CD14 CD45 FLAER检测PNH粒 单核及淋巴细胞 报告标本中各系细胞FLAER阴性比例 31 32 33 FLAER 目前FLAER一般用于有核细胞的检测 不能评价红细胞的PNH克隆 由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类 尽管表达在红细胞表面的血型糖蛋白不是锚连蛋白 但是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结合力较弱 因此限制了FLAER在红细胞中的应用 34 与CD55 CD59比较 Flaer对PNH患者对中性粒细胞的测定最为清晰 准确临床上高度怀疑
10、而CD55 CD59不能确诊的病例 可以结合F1aer检查 获得明确诊断 35 谢谢 36 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料仅供参考 实际情况实际分析 37 主要经营 课件设计 文档制作 网络软件设计 图文设计制作 发布广告等秉着以优质的服务对待每一位客户 做到让客户满意 致力于数据挖掘 合同简历 论文写作 PPT设计 计划书 策划案 学习课件 各类模板等方方面面 打造全网一站式需求 38 感谢您的观看和下载 Theusercandemonstrateonaprojectororcomputer orprintthepresentationandmakeitintoafilmtobeusedinawiderfield 39
