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1、NANCHANG UNIVERSITY 学学 士士 学学 位位 论论 文文 THESIS OF BACHELOR 题 目 orfH79 基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定 学 院 生命科学院 系 生物技术系 专业班级 生物工程 南南 昌昌 大大 学学 学士学位论文原创性申明学士学位论文原创性申明 本人郑重申明 所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果 除了文中特别加以标注引用的内容外 本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式表明 本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担 作者签名 日期 学位论文版权
2、使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和 借阅 本人授权南昌大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密 在 年解密后适用本授权书 本学位论文属于 不保密 请在以上相应方框内打 作者签名 日期 导师签名 日期 orfH79 基因转化大肠杆菌丙酮酸激酶酶活的测定 摘要 II 专 业 生物工程 学 号 XXX 学生姓名 XX 指导教师 XXX 摘要 细胞质雄性不育 CMS 现象在植物中普遍存在 表现
3、为雄性败育 但雌配 子和营养生长正常 用于三系杂交水稻避免人工去雄 具有很高的实用价值 然而细胞质雄性不育是细胞核质互作的结果 可以为研究核质互作的分子机理 提供一个很好的材料 线粒体基因组分子内形成异常嵌合基因是 CMS 产生的基 础 由于水稻花药线粒体体外培养及植物线粒体直接转化技术的限制 水稻 CMS 分子机理研究进展缓慢 然而细菌基因的转录和翻译及能量合成方式与线 粒体具有较大的相似性 线粒体基因orfH79是水稻红莲型细胞质雄性不育基因 所以本实验将不育基因导入大肠杆菌中来研究 线粒体中央是基质 基质内含 有与三羧酸循环所需的全部酶类 内膜上具有呼吸链酶系及 ATP 酶复合体 线 粒
4、体对呼吸作用的能量代谢起重要作用 而丙酮酸激酶是能量代谢的关键酶 本实验就是研究orfH79基因对丙酮酸激酶的影响 即通过测酶活来表明 就是 看orfH79基因对丙酮酸激酶的酶活的影响 本实验就是通过测定管和对照管的 丙酮酸激酶酶活的大小 来推出 orfH79 基因对丙酮酸激酶的酶活影响 最终推 出不育基因对丙酮酸激酶的影响 关键词 细胞质雄性不育 orfH79 基因 大肠杆菌 丙酮酸激酶酶活 orfH79 transformed e coli enzyme Abstract III determination of pyruvate kinase Abstract The phenomeno
5、n of cytoplasmic male sterility CMS is widespread in plants performance of abortive male but female gamete and vegetative growth normal It is used for three line hybrid rice to avoid artificial emasculation has the very high practical value Cytoplasmic male sterility CMS is the nucleus interactions
6、however as a result to study on molecular mechanism of karyoplasm interaction provides a good material Mitochondrial genome within molecules form abnormal chimeric gene is the basis of CMS to produce because the rice anther mitochondrial mitochondria in vitro culture and plant the limitation of dire
7、ct conversion technology rice CMS molecular mechanism research progress has been slow However bacterial gene transcription and translation and energy synthesis method and mitochondria has great similarities Mitochondrial genes orfH79 type is red violet rice cytoplasmic male sterile genes So this stu
8、dy will research sterility gene into e coli Mitochondria the central is a matrix matrix contains all the required enzymes and the Krebs cycle the lining of respiratory chain enzymes and ATP enzyme complexes This experiment is to study the effect of orfH79 gene of pyruvate kinase namely by measuring
9、the enzyme activity show that is watching orfH79 genes affect enzyme activity of pyruvate kinase This study is through the tube and to take care of the size of the pyruvate kinase enzyme activity to launch orfH79 genetic influence on the enzyme activity of pyruvate kinase finally introduced sterilit
10、y gene effects on pyruvate kinase Key words cytoplasmic male sterility OrfH79 gene E coli Pyruvate kinase enzyme activity 目录 摘要 目录 IV Abstract 目 录 第一章 引言 1 1 1 植物细胞质雄性不育研究意义 1 1 2 植物细胞质雄性不育可能的形成机理 1 1 3 线粒体基因与植物细胞质雄性不育 2 1 4 利用大肠杆菌研究植物细胞质雄性不育 3 1 5 丙酮酸激酶与线粒体的关系 5 1 6 研究目的及意义 5 第二章 材料与方法 7 2 1 实验材料与试
11、剂 7 2 2 试验方法 8 第三章 实验结果与分析 10 第四章 实验讨论 13 4 1 微量 orfH79 蛋白抑制丙酮酸激酶的酶活 13 4 2 orfH79 基因抑制大肠杆菌生长机理 14 参考文献 16 致谢 19 第一章 引言 1 第一章 引言 1 1植物细胞质雄性不育研究意义 植物细胞质雄性不育 cytoplasmic male sterility CMS 是一种因线粒体基 因区域的改变 突变 重排 转座等 所导致的 不能产生有活力花粉的母状 遗传性状 是高等植物中较为常见的生物学特征 广泛存在于大约 150 个物种 中 由于细胞质雄性不育系统在研究核质互作 细胞器遗传转化 杂交
12、种商业 化生产等方面所具有的优势 科学家们做出了长期的努力 希望弄清其形成机 理 以前的研究大多集中在对 CMS 的花粉败育时期和原因 不育的稳定性及可 恢复性等进行了较多的经典研究 随着分子生物学理论和技术的迅速发展更新 特别是细胞器分离技术和离体翻译体系的建立 极大地推进了在分子水平对植 物细胞质雄性不育机理的研究 丰富了人们对 CMS 现象的认识 本文则是利用 水稻雄性不育来研究核质互作 1 2 植物细胞质雄性不育可能的形成机理 尽管在一些植物中已经鉴定出与 CMS 有关的线粒体 DNA 片段 但是对植 物细胞质雄性不育的机理仍然知之甚少 一般推测 植物 CMS 形成机理有两种 第一种线
13、粒体基因组中新的嵌合阅读框与其相邻近的保守基因共转录 造成保 守基因的单顺反子转录本减少 从而减少了保守基因编码的蛋白量 致使植物的 某些功能异常或丧失而不育 第二种新的嵌合阅读框编码了一个毒性蛋白 该 蛋白干扰保守基因的生物活性或干扰花药发育中的生理生化过程从而中断花粉 发育形成雄性不育 从恢复基因对 CMS 的影响来看 如果是第一种原因引起 CMS 那么相应的 恢复基因就应该是通过恢复保守基因的表达量来起作用 对几种植物 CMS 的研 究显示 在恢复基因有与无的两种遗传背景下 虽然嵌合基因的转录模式有明 显不同 但都可以检测到线粒体保守基因转录本的存在 且在量上没有明显的 区别 这表明第一
14、种解释并不理想 对第二种解释目前有较多的实验支持 He 等将含特异启动子 线粒体转导 序列 菜豆的不育相关基因orf239的序列导入烟草细胞核基因组 获得了几株 第一章 引言 2 含有orf239的不育和半不育的转基因植株 免疫细胞学分析表明 在转基因植 株中异常发育的小孢子细胞壁表达出不育相关蛋白 orf239 认为 orf239 序列的 表达可能与转基因烟草的花粉败育直接相关 赵荣敏等学者将 orf224 部分编码 序列及全长序列导入大肠杆菌 结果发现具有 orf224 特异表达产物特征的大肠 杆菌生长减缓 推测 orf224 可能编码一个毒蛋白 在此研究水稻的不育情况利 用的是 orfH
15、79 基因 来研究水稻不育情况的形成途径 1 3 线粒体基因与植物细胞质雄性不育 高等植物线粒体基因组尽管非常庞大 但所编码的功能基因有限 拟南芥 线粒体因组 DNA 是至今唯一全序列测定的高等植物线粒体基因组 全长 366924bp 的 DNA 序列只编码 57 个基因 高等植物线粒体基因的编码序列保守 性很强 而编码区以外的序列保守性很低 这个特点有利于利用已知基因研究 其它各种植物线粒体基因的多态性变在植物线粒体中还 DNA 含有一些开放的阅 读框架 它们能转录 但其功能和编码蛋白不清楚 这些阅读框有的是通过线 粒体基因组重排而形成的嵌合基因 在不同植物中发现的近 20 个不同嵌合基因
16、中有的与植物雄性不育性有关 1 3 1 确定细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段的方法 确定与细胞质雄性不育相关基因或基因片段 可采用以下几种材料 1 不 育系和保持系 2 不育系和育系的自发回复突变体 3 组培或原生质体融合分 化产生的不育和可育植株 可以采用如下方法 1 用已知线粒体基因作探针对 上述材料线粒体 DNA 进行 RFLP 分析或 Northern 分析 寻找二者间存在差异 的基因 2 用限制性内切酶消化不育和正常胞质线粒体 DNA 直接从分离胶上 回收并克隆不育或正常 mtDNA 特异片段 3 用 AP PCR RAID 或 AFLP 等方 法比较正常和不育胞质线粒体 DNA 差异 克隆不育系特异的扩增片段 4 用差 异展示的方法 寻找不育与正常胞质线粒体差异 RNA 以上 4 种方法获得的差 异片段可直接作为探针从线粒体 DNA 文库或 eDNA 文库中筛选阳性克隆 进 而确定与细胞质雄性不育有关的阅读框 1 3 2 与细胞质雄性不育有关的线粒体基因或片段 水稻 BT CMS 不育系统的线粒体的 DNA 含两个 atp6 基因 而保持系只有 第一章 引言 3 一个
