《《银杏4CL基因克隆及分析》-毕业论文·公开DOC》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《银杏4CL基因克隆及分析》-毕业论文·公开DOC（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、学号:200724140210本 科 生 毕 业 论 文（设 计）题 目:银杏4CL基因克隆及分析作者姓名:专业班级:生物科学2007级02班指导教师:化学与生命科学学院二零一一年五月目 录中文摘要1英文摘要(Abstract) 21 前言31.1 银杏的基本情况介绍31.1.1 银杏的植物学简介31.1.2 银杏价值简介31.2 4CL基因的基本情况介绍41.2.1 4CL基因简介41.2.2 银杏中的4CL基因41.3 4CL基因研究新进展41.3.1 4CL基因的作用41.3.2 4CL基因的结构51.3.3 4CL同工酶的研究51.4 基因克隆的常用方法61.4.1 根据已知序列克隆基
2、因61.4.2 根据已知探针克隆基因61.4.3 未知序列的基因打靶61.4.4 用特异抗体克隆基因71.4.5 特异基因的功能克隆81.5 脱落酸等植物激素对银杏类黄酮含量的影响81.6 本研究的基本思路和研究意义82 材料与方法92.1 实验方案92.1.1 实验方案的设计92.1.2 技术路线92.1.3 实验方法的选择102.2 实验原理112.2.1 RNA提取112.2.2 琼脂糖凝胶电泳112.2.3 反转录112.2.4 简并PCR及RACE技术112.2.5 TA克隆122.2.6 大肠杆菌感受态122.2.7 大肠杆菌的转化122.2.8 阳性克隆的鉴定122.3 实验材料
3、132.3.1 材料132.3.2 主要试剂与药品132.3.3 主要仪器与设备132.4 实验方法132.4.1 RNA提取液的制备132.4.2 银杏叶片RNA的提取142.4.3 银杏叶片RNA电泳检测142.4.4 反转录152.4.5 利用反转录得到的cDNA进行简并PCR操作152.4.6 RACE操作162.4.7 TA克隆162.4.8 大肠杆菌感受态的制备162.4.9 大肠杆菌的转化172.4.10 阳性克隆的鉴定172.4.11 测序183 结果与分析183.1 银杏叶片RNA提取183.1.1 提取结果183.1.2 结果分析183.2 PCR扩增193.2.1 扩增结
4、果193.2.2 结果分析193.3 TA克隆193.3.1 克隆后检测结果193.3.2 结果分析193.4 4CL基因测序203.4.1 克隆后测序结果203.4.2 结果分析214 讨论224.1 讨论224.2 有待进一步研究的问题22参考文献24致谢26银杏4CL基因克隆及分析银杏4CL基因克隆及分析李琼化学与生命科学学院 生物科学专业 200702班摘要：本文从裸子植物银杏叶片中提取出总RNA，将总RNA进行反转录得到cDNA，再利用简并PCR技术扩增得到银杏4-香豆酸：CoA连接酶（4-coumarate: CoA ligase，简称4CL）基因片段，然后采用RACE技术进行基因
5、全长的扩增。得到4CL全长基因后利用TA克隆技术测序得到基因的核酸序列、预测氨基酸序列和cDNA预测蛋白质3D结构图。核酸序列结果显示4CL基因片段全长787 bp，编码211个氨基酸。由此序列推导的氨基酸序列中，并不存在4CL蛋白特有的保守序列，但含有两个底物结合域。4CL是类黄酮生物合成过程中的关键酶之一，因此4CL基因的表达量高低及活性大小会影响类黄酮含量的高低，希望能为4CL基因的相关研究提供一些理论依据。关键词：银杏；4-香豆酸：CoA连接酶；RNA；PCR技术；类黄酮 Cloning and analysis of 4CL Gene inGinkgo bilobaLI QiongC
6、lass200702, Biology, College of Chemistry and Life Science, HNUAbstract: In this passage, we first take total ribonudleic acid from leaves of Ginkgo biloba, then get cDNA from reverse transcription. We get 4-coumarate: CoA ligase gene from degenerate PCR after that. At last, using rapid-amplificatio
7、n of cDNA ends technology to get full-length of the gene. After it, realizing the target of nucleic acid sequences, predicted amino acid sequences and predicted protein sequences of 4CL gene through TA cloning technology. The nucleic acid sequences show that 4CL gene has 787 bp and it encodes 211 am
8、ino acids. The predicted protein sequences of 4CL gene show that there isnt have a protein peculiar conservative sequence, but contains two substrates combining domain. 4CL gene are the key enzyme of biosynthesis process of flavonoids, so the expressions can also control the amount of flavones, then
9、 according it, we hope that my study can give some theoretical basis for further studies.Keywords: Ginkgo biloba; 4-coumarate: CoA ligase; Ribonudleic acid; Polymerase Chain Reaction; Flavonoids 1 前言1.1 银杏的基本情况介绍1.1.1 银杏的植物学简介 银杏为落叶乔木，叶扇形，在长枝上散生，在短枝上簇生。球花单性，雌雄异株。种子核果状。5月开花，10月成熟，果实为橙黄色的种实核果1。一种孑遗植物，
10、和它同门的所有其他植物都已灭绝。银杏是现存种子植物中最古老的孑遗植物。1.1.2 银杏价值简介银杏（Ginkgo biloba），是现有种子植物中最古老的孑遗植物，又称“活化石”。银杏寿命长，又名“公孙树”2。它原产中国，具有极高的经济、生态、观赏和科研价值，集核用、叶用、材用、花粉用及观赏用于一身，银杏体内化学物质的药用价值，已受到世界范围内研究者日益广泛的关注。银杏中存在两类重要的生理活性物质黄酮类化合物（Flavonoids，主要有单黄酮、双黄酮、儿茶素等）和萜内酯（银杏内酯Ginkgolides，包括内酯A，B，C，J，M和白果内酯bilobablides，BB）2。其中黄酮类化合物具
11、有捕获自由基、扩张冠状血管、改善血管末梢和脑血管循环、降低胆固醇、解除平滑肌痉挛、松弛支气管等作用。因此，银杏叶提取物具有促进血液循环及脑代谢等功能，对治疗中老年冠心病、高血压等心脑血管病、内毒素休克、器官排异反应、气管炎、哮喘等具有较好的效果。有报道指出，银杏药物具有抗衰老、抗老年痴呆症、增强记忆力的功效，因而银杏叶也用于研制营养口服液、保健食品和化妆品等。近十几年来，德国、日本、法国等纷纷从我国高价进口银杏叶片，尤其是高质量的银杏叶片或银杏叶提取物。但由于叶片质量较差或提取的中间产物药用成份如黄酮含量较低，严重影响了加工成本和加工工艺，因此造成叶片压价甚至积压，极大的挫伤了银杏种植业和加工
12、业，制约了银杏产业的发展2。因此通过提高银杏叶黄酮含量，从而提高银杏叶片质量来获得较高的利润是我国银杏种植业急需解决的问题。近年来国内外学者对银杏叶黄酮的研究，特别是如何提高银杏叶黄酮含量已成为研究的热点与难点。目前提高银杏叶黄酮含量一个重要的途径是提高银杏叶黄酮相对百分含量。关于这一途径，前人已有大量的报道，事实证明采用生理生化途径调控银杏叶黄酮相对百分含量是一种有效的方法。而且，近年来对银杏叶黄酮分子生物学的研究也表明，利用植物基因工程技术对银杏进行遗传改良或在分子水平上调控银杏叶黄酮合成途径中关键酶的活性，也将会为提高银杏叶黄酮含量开辟新的途径且具有良好的前景。加强上述两方面的研究，以充
13、分提高银杏叶的药用成分黄酮含量为目的，不仅能提高银杏叶片质量带来经济效益，同时还能为阐明银杏黄酮的代谢网络途径奠定基础，具有重要的理论意义。1.2 4CL基因的基本情况介绍1.2.1 4CL基因简介4CL基因全称为4-香豆酸辅酶A连接酶，是连接苯丙氨酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯，是合成木质素与其它苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。4CL基因通常以基因家族形式存在于植物中。早期研究发现抑制该酶表达会使拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）的木质素含量下降。近来，Lu等3对4CL进行了过表达研究，发
14、现4CL基因能够在转化的烟草茎中稳定特异地表达，酶活性增加了2倍的同时，木质素含量也增加了25%。这表明，无论抑制还是过表达4CL基因都能较好地按照人们的意愿改变植物体内木质素的合成，是较理想的目标基因3。1.2.2 银杏中的4CL基因4-香豆酸辅酶A连接酶是类黄酮生物合成过程中的关键酶之一3，它位于苯丙烷类衍生物生物合成的分支点和类黄酮、木质素以及肉桂酸酯分支代谢途径的交叉点上1, 4, 5，对整个代谢过程起着重要的调节控制作用。1.3 4CL基因研究新进展1.3.1 4CL的作用4CL作用于苯丙氨酸途径中最后一步反应，催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯，这些硫酯均处于苯丙氨酸代谢途径和各种末
15、端产物特异合成途径的分支点处3。以前认为4CL主要以香豆酸、咖啡酸和阿魏酸为催化底物，不以芥子酸为底物，由此推测S木质素的合成途径可能并不经过芥子酸。然而Lindermayr等6从大豆（Glycine max）中分离了一种4CL同工酶，以芥子酸为底物催化分成芥子酞辅酶A。另外Yamauchi等6以四种植物为研究对象，进行放射性同位素示踪实验，结果表明洋槐（Robinia pseudoacacia）和夹竹桃（Nerium oleander）中的芥子酸可最终生成芥子醇，而在拟南芥中却不能。这一结果揭示出被子植物中4CL催化底物特异性因植物种类而异。1.3.2 4CL基因的结构Voo等6从火炬松（Pinus taeda）木质部中克隆出了一个4CL cDNA，编码64 kD多肽，Hauffe等6从荷兰芹（Petroselinum crispum）中分离出的4CL1基因及启动子可在植物茎中特异表达，现
