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1、1 引言 叶绿素（Chlorophyll）是植物体内光合作用赖以进行的物质基础，广泛存在于高等植物的叶绿体中，是叶绿体中最为重要的一类光合色素。早在1818年，Pellatier首先从植物中萃取得到一种绿色色素并命名为叶绿素。1838年Berzelius报道了有关叶绿素的萃取方法。到1864年Stoke又发现叶绿素并非单体，而是绿色色素的混合物。但直到1906年，色谱法的发明者Tsvet才成功地从高等植物的叶绿体中分离出的叶绿素A和B。随后在1993年Willstatter成功地阐明了叶绿素的结构，他因此获得1915年度的诺贝尔化学奖。到了60年代，人们成功地人工合成叶绿素。 1.1叶绿素物化
2、性质 叶绿素是一类含镁卟啉衍生物的泛称，其中以叶绿素A和叶绿素B最为常见。叶绿素的分子中都含有一个卟啉环，Mg2+取代了环内二氢并与4个N原子配位形成相应的金属配体。除高等绿色植物叶绿体中含有比例3：1的叶绿素A和叶绿素B外，在多种藻类植物中还发现有叶绿素C类物质，包括叶绿素C1和C2两种成分。此外，在红藻中则发现叶绿素D的存在。叶绿素A和叶绿素B是蓝绿色的蜡状晶体，呈深绿及墨绿色油状或糊状物，略带异臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂。故常利用乳化剂制成具水分散性制剂。相对分子质量分别为893和907，其中叶绿素A的熔点为150153，叶绿素B的熔点为183185。天然叶绿素不稳定
3、，对光和热敏感，易分解褪色。在酸性条件下，叶绿素的卟啉环中心金属镁原子会被氢原子置换，生成暗绿色至绿褐色脱镁叶绿素。从化学性质上讲，叶绿素是一种双羧酸酯，叶绿酸的两个羟基分别被甲醇(CH3OH)和叶绿醇(C20H38OH)酯化。叶绿素a和叶绿素b的结构如图1,2。叶绿素a和b的分子中的镁离子易被铜、铁、钻等离子取代而成为叶绿素衍生物(chlorophyllin)。现在市售是将铜置换中心金属镁后成叶绿素铜，再将其制成水溶性叶绿素铜钠，或用铁置成叶绿素铁，再制成水溶性叶绿素铁钠等钠盐。叶绿素铜钠和叶绿素铁钠为兰黑色墨绿色粉末，无臭或略带氨臭，溶于水，微溶于乙醇，氯仿，不溶于油脂。其耐光性比叶绿素强
4、，在酸性溶液中因钠脱离呈水不溶性。在存有钙，镁离子情况下会生成不溶性盐，所以，须注意用水水质，若用硬水，会有析出现象。（2） 叶绿素衍生物的种类及性质叶绿素衍生物有叶绿素钠盐，叶绿素铁钠盐，叶绿素铜钾盐，叶绿素锌钠盐，叶绿素镁钠盐，叶绿素钾钠盐，叶绿素铜钾钠盐等，其对光，热，酸，碱的稳定性大大提高。其钠盐或铁钠盐又分为二钠盐和三钠盐。结构如图3。叶绿素的盐类衍生物为兰黑色至墨绿色的粉末，无臭或略带氨臭。 图3 叶绿素及其钠盐 叶绿素铜钠为兰黑色一墨绿色粉末，无臭或略带氨臭，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿，不溶油脂，耐光性比叶绿素强，在强酸性溶液中呈水不溶性，在体系中有Ca2+ , M g2+离子时
5、会生成不溶性盐。 叶绿素铜钠之所以较叶绿素稳定是由于其符合下列条件：1离子结构方面:Cu2+为11一18电子构型的离子，为配位能力最强的形成体，可形成稳定的配位化合物;而M g2+为具有气体结构型的离子。 2)硬软酸碱原则(HSAB原则):路易斯将酸碱分为硬酸、软酸、交界酸和硬碱、软碱、交界碱各3类，而Cu2+为交界酸，叶琳结构中的吡咯为交界碱(吡咯可看作一个环状的亚胺，分子中存在一N一原子团，由于氮上未共用电子对参与杂环上其共扼体系，因而碱性与苯胺(交界碱)相似)，故可因软酸与软碱结合形成稳定配位化合物;而M g2+为硬酸不具备此条件 3)晶体场稳定化能: Cu2+离子在平面正方形场中的稳定
6、化能无论在弱场或强场都较M g2+在四面体场的稳定化能大. 叶绿素铜钠有与叶绿素类似的生理功能，如国外已将叶绿素铜作为保护胃壁药物销售，叶绿素铜钠则被认为对慢性荀麻疹、慢性湿疹、支气管哮喘有明显疗效，并对口臭的挥发性硫化物有抑制作用.FAO/W H O(1985)规定，叶绿素铜钠的每人允许摄取量为0 m g/kg- 15 m g/kg，我国在食品中的最大允许添加量为0. 5 g/kg，其作为食品加工中的染色剂、脱臭剂已广泛用于口香糖、硬糖、果汁、汽水、配制酒、罐头、果蔬加工品、糕点等食品中. 叶绿素铜钠一般可从蚕沙、松叶、竹叶或藻类中提取.据介绍，从竹叶中提取叶绿素在室内散射光照和 100受热
7、的条件下，有良好的耐受性，而在110以上较长时间强热下稳定性明显下降，色泽变浅直至无色.12 叶绿素的合成制取叶绿素常以雏菊，苜蓿，小球藻或蚕粪等为原料，经丙酮等有机溶剂萃取可得以叶绿素a，b为主混合物，略呈异臭。但这种天然叶绿素遇热，光（特别是紫外线）易分解，褪色，并对酸非常不稳定，遇酸时中心金属镁被氢置换脱离成暗绿至绿褐色脱镁叶绿素即叶绿素衍生物。为此常以铜，镁，钴等置换叶绿素中心金属镁，进行稳定化，如叶绿素加丙酮，甲醇后，再加氯化铜甲醇溶液加热搅拌，由铜置换中心金属镁得叶绿素铜，其耐光性佳，脱臭性强，加热流动性好，可作食用色素。但加酸铜被氢置换，成脱镁叶绿素。 现以从竹叶中提取叶绿素为例
8、：叶绿素提取工艺 先将鲜竹叶捣碎，洗涤后过滤，滤渣用6倍量的食用酒精浸溃，在反应釜中进行第一次提取，提取的时间为半小时。浸提后进行过滤，滤液用于提取叶绿素，滤渣用于进行第二次提取。第二次浸提亦用6倍量的食用酒精，滤液用于第一次浸提，滤渣用于第三次浸提，如此进行四次提取，其工艺流程如图1所示。 利用减压蒸馏浓缩器在较低温度情况卜将酒精蒸出，一般温度以不超过45为宜。可得叶绿素含量大于13%的浸膏。此步如采取喷雾干燥，可得粉状产品。提取叶绿素后的滤渣中含有大量叶蛋白和矿物质等营养物质，可作为饲料原料直接使用。 3 叶绿素衍生物的合成及反应3.1叶绿素盐类衍生物的合成 通常以Hanninen选择性水
9、解法直接将蚕沙糊状叶绿素中的叶绿素a水解为脱镁叶绿一酸a，通过盐酸-乙醚分级分离而将脱镁叶绿一酸a与糊状叶绿素中的其它组分分开。再用不同浓度的碱将脱镁叶绿一酸a水解成脱镁叶绿二酸a和脱镁叶绿三酸a。用这三种叶绿酸a衍生物做为合成叶绿素铁钠盐和叶绿素铜钠盐的结构单体，采用下列方法制备叶绿酸a铁（铜）置换体。1. 叶绿酸a合成叶绿酸a铁钠盐在抗坏血酸存在下，将PH值控制在1-2, 60水浴置铁lh，铁酸经洗涤后成盐。2. 叶绿酸a合成叶绿酸a铜钠盐将反应液pH控制在2.5左右，60水浴置铜0.5h，铜酸经洗涤后成盐。研究比较这三种金属置换体的光谱数据，铁（铜）络合量与结构的关系。结果表明，脱镁叶绿
10、二酸a是三种衍生物中最适于制备金属置换体的结构，以该结构制备的铁钠盐，其吸收峰、特殊消光值、消光比值基本符合日本食品卫生标准，铁络合量可达3.5。以该结构制备的铜钠盐，铜络合量（总铜）可达7.0以上。经实验证明脱镁叶绿二酸a在无水乙醇中的波长-消光曲线，吸收峰为406nm和645nm。并确定了它是叶绿酸a中制备叶绿素金属置换体的最适结构。本实验中采用的制备叶绿酸a铁钠盐的方法比较稳定，可为生产提供一些参考。其中脱镁叶绿酸a 的结构和反应体系的pH值是影响铁络合量的关键因素，因而在制备铁钠盐的过程中，应将脱镁叶绿酸a结构控制为脱镁叶绿二酸a, pH值严格控制在1-2。铁结合量的高低应是决定光谱数
11、据指标的决定因素。 原理 叶绿素主要存在于绿色植物中。现己有报道以竹叶、地椒草、二叶草、首蓓叶、竺麻叶、羊蹄甲树叶，蚕砂等为原料.用溶剂萃取.经皂化与铜代来制备叶绿素铜钠盐。 色素结构转变的机理如下:工艺路线(一)原料、浸取、过滤、浓缩、皂化、分离、调酸、铜代、过滤、成盐、干燥、成品原料经粉碎后，进行浸取，浸取常采用有机溶剂，并辅以搅拌.并维持恒温70左右。过程一般要持续3- 4h。有机溶剂可用丙酮，丁醇，一氯甲烷，乙醇，石油醚，异丙醇，三氯乙烯等。一般采用95%的乙醇溶液。浸取后.经过滤分离得墨绿色溶液.通常在皂化之前将浸取液浓缩。皂化是为了除去甲基和叶绿基酯基。向浓缩液中加入NaOH，在7
12、0左右搅拌约1h，冷却后用石油醚萃取，以除去叶黄素，胡萝卜素等杂质。分离出石油醚，皂化液用浓盐酸调pH值至2-3.准备铜代。加入CuS04溶液，在70左右恒温搅拌一段时间，冷却，静置，然后抽滤得粗品。用蒸馏水，40%乙醇，石油醚各洗涤沉淀一次。用丙酮将沉淀溶解，滴加5% NaOH乙醇溶液至PH= 12，使叶绿素铜钠析出。抽滤，固体烘干得产品。特点:此法为一般的工艺方法，易实施。路线(二)该路线与路线(一)大致相同，只是在纯化阶段有所不同。此法主要采用酸化结晶的方法，即在得到粗品后，加入盐酸，并加入一定浓度和量的结晶诱导剂，搅拌，静置，抽滤后可得到叶绿素铜酸固体。然后使之溶于某一非极性溶剂中，缓
13、缓加入某一极性溶剂，于45搅拌约20分钟，冷至25 ,静置50分钟，这是一个反萃结晶过程。抽滤，即可得到精制的叶绿素铜酸。然后再制备叶绿素铜钠盐.。纯化流程如下:铜代液、加盐酸、加结晶诱导剂、抽滤、溶解、反萃结晶、士由滤、精制品 特点:此法主要是将产物以叶绿素铜酸(固体结晶)的方式从铜代液中析出，使产物析出完全，杂质少，但溶剂消耗大。路线(三)在浸取阶段采用了色谱分离法，即将原料浸泡后，使用一个层析用玻管。用少许脱脂棉填于底部。将浸液移入管中，使绿色渗辘液从管底流出，同时补充乙醇。待渗出液绿色己很浅时，可停止渗辘。此法的其它工艺阶段与路线(一)一致。特点：这种方法速度慢，.耗时长，但得到的提取
14、液的纯度很高。路线(四) 在浸取后，先进行酸化置铜，然后皂化，此时己有叶绿素铜盐产生。在回收部分乙醇后，用石油醚萃取滤液，除去杂质，接着用浓盐酸调节pH= 2- 3，再加入蒸馏水，静置后，铜酸固体浮起。分别用水和乙醇洗涤铜酸，而后抽干。在净化后的铜酸中加入NaOH溶液，抽干，烘干得产品。特点：此法先铜代后皂化有利于叶绿素稳定性的增强，对工艺的温度要求不苛刻，可节省大量有机溶剂，产品纯度较高。3.1.1 氯化血_红素和叶绿素是生命中的主要物质，它们均为四吡咯金属配合物,在一定条件卜可相互转化成各系列的衍生物，在补血_剂、光增感剂和分子机能材料等方而有着重要的应用。但日前许多研究工作主要以叶绿素为
15、原料，采用半合成方法制备叶绿素衍生物。本文以叶绿素为原料，在合成甲基原焦脱镁叶绿酸a的基础上，进一步合成具有血红素核心结构的卟啉衍生物原脱镁叶绿酸a甲基酯，为半合成其它卟啉类衍生物提供基础。3.1.1.1 脱镁叶绿酸a甲基酯的制备 蚕沙粗品叶绿素a(200g)溶少乙醚（ 500ml）.加入36%盐酸( 500m1. )于0。暗处搅拌30min，静置，分取下层酸液，用N a0H( 10mol/ 1)中和至ph= 45，过滤，干燥，得脱镁叶绿酸a粗品。薄层色谱检测三氯甲烷-丙酮-甲酸(70:29: 1)展开，呈3个主要斑点。经硅胶柱色谱分离，收集第一谱带洗脱液，减压浓缩。用四氢吠喃/正己烷重结晶得脱镁叶绿酸a结晶(图2)。 将以上固体溶于乙醚.在冰盐浴上加入过量新配制的CH2N2/乙醚溶液.反应5min，滴加醋酸除去过量的CH2N2，饱和NaCI溶液，洗后用Na2S04干燥.浓缩至干。硅胶柱色谱分离得绿黑色脱镁叶绿酸a甲基酯。3.1.1.2 锌脱镁叶绿酸a甲基酯的制备：脱镁叶绿酸a甲基酯(100mg, 0. 185mol)溶于CH2Cl2(100m1
