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1、 届 别 2008 届学 号 200814140140 毕业设计（论文）题 目：仙人掌中总生物碱的提取及抗肿瘤作用的研究姓 名 系 别 、专 业 化生系 药学专业 导师姓名、职称 教 授 完 成 时 间 2012年5月6日 目录摘要Abstract1概述 51.1天然药物抗肿瘤作用的研究 51.2 仙人掌的主要化学成分51.3 仙人掌其他药理作用5 1.4 仙人掌抗肿瘤作用研究62实验设计62.1 材料62.1.1研究对象62.1.2实验对象62.1.3实验仪器62.1.4实验试剂72.2方法 72.2.1 生物碱的提取分离与精制 72.2.2 生物碱类物质的鉴定72.2.2.1化学检测法72
2、.2.2.2薄层层析检查法72.2.3白血病HL-60细胞培养7 2.2.4仙人掌的抑瘤实验72.2.4.1准备工作 72.2.4.2接种细胞 82.2.4.3加药培养 82.2.5倒置荧光显微镜观察法测定82.2.6 MTT法 83结果94讨论135参考文献146致谢16摘要目的：探讨仙人掌中生物碱类对HL-60细胞的抗肿瘤作用。方法：采用乙醇回流提取法，从仙人掌中提取生物碱类，以HL-60细胞为实验用肿瘤细胞，应用荧光倒置显微镜观察仙人掌中生物碱类对K-562细胞形态学的影响，并采用MTT法研究仙人掌中生物碱类对HL-60的抑制作用。结果：仙人掌中生物碱类对HL-60细胞的生长有的抑制作用
3、，但是所需要的抑制浓度较大。结论：仙人掌中生物碱类对HL-60细胞的抗肿瘤作用作用在低浓度时作用较小，高浓度时作用较为明显。关键词： 仙人掌总生物碱;抗肿瘤; MTT法;HL-60细胞ABSTRACTAIM:To explore the anti-tumor effects of alkaloids in the cactus on HL-60 cells METHOODS: Use ethanol extraction method to extract alkaloids from the Cactus, Experiments with tumor cells to HL-60 cell
4、s, Use fluorescence inverted microscope to observe of the cactus alkaloids on the morphology of HL-60 cells .The inhibitory ratio of the cells were measured by MTT assay.Results: Cactus alkaloids have some inhibition of growth of HL-60 cells,But the Inhibitory concentration of it is high.Conclusion:
5、 Cactus alkaloids only have a little anti-tumor effect on HL-60 cells .Key words: Cactus alkaloids;anti-tumor; MTT method ;HL-60 cell1概述1.1天然药物抗肿瘤作用的研究天然药物一般指来源于植物、动物、微生物、海洋生物和矿物的药物。它往往具有结构新颖、活性高、副作用少的特点，是制药工业中新药研发的重要来源。 当前天然药物具有很大的发展潜力，250000种高等植物中只有515%被筛选过，海洋生物中的活性化合物也只是刚刚涉及。我国生物资源丰富，天然药物的应用有悠久的历
6、史。统计资料显示，我国药用资源约12694种。其中药用植物11020种，动物1590种，矿物84种。1 天然产物种类繁多，因而其生物活性也多种多样。在众多的生物活性中，抗肿瘤活性是很重要的一个研究内容。近年来，随着癌症发病率的不断升高，肿瘤已成为现代研究的一个热点和难点。化疗所需要的药物中有很多是天然产物，比如长春新碱，紫杉醇，喜树碱等，这几种天然产的抗肿瘤药物已经用于临床，效果非常显著。具有抗肿瘤活性的天然产物在许多天然药物中都存在，按照来源区分它们可以来自中草药（植物）、海洋生物以及微生物等。按照化学结构区分它们可以包括生物碱、黄酮、蛋白质（肽）、多糖等。2因此，从中草药及天然产物中寻找具
7、有抗肿瘤活性的化学成分已成为新药研发的重要思路和手段。近年来，仙人掌的药理作用已成为医学研究的热门方向。此次将对仙人掌的抗肿瘤作用做进一步的研究.1.2仙人掌的主要化学成分仙人掌(Opuntia) 属植物系仙人掌科双子叶植物。目前仙人掌科的植物将近有2000种。仙人掌含丰富的蛋白质、维生素、胡萝卜素、l0多种矿物质和l8种氨基酸，人体所必须的氨基酸几乎都在其中，还含有机酸类、糖类、黄酮类、生物碱类、甾醇类、萜类和总皂苷等具有较强药理作用的化学成分。仙人掌肉质茎中含有多种生物碱, 其中主要为酪胺、N- 甲基酪胺、3- 甲氧基酪胺、- 苯乙胺、大麦芽碱等3酪胺更是仙人掌中生物碱的重要成分41.3仙
8、人掌的其他药理作用在我国仙人掌作为药用植物已有悠久的历史。其性苦、凉, 具有清热解毒、散淤消肿、健胃、止痛、镇咳等功效。仙人掌有的根和茎,其味苦、寒,入心、肺、胃三经,具有活血行气、清热毒之功效,主治心胃气痛、痞块、肺痈、乳痈、烫火伤、蛇伤等9其所含的营养成分和生物活性成分的发现和提取及其生物学作用是当前营养学研究的热点.尤其是仙人掌中的多糖类、黄酮类和生物碱等成分的生物作用。近年来的研究表明,仙人掌具有抗炎、消肿、抑菌作用和有抗脂质氧化以及降血糖的作用10。此外其降血压作用和镇痛的作用也不断被发现11，这些作用为许多慢性疾病和肿瘤的预防及治疗开辟了许多新的途径.1.4抗肿瘤作用近年来发现仙人
9、掌果和茎有较强的抗肿瘤作用5。韦启后等研究表明接种后给药7、14d 对S180 荷瘤小鼠的抑瘤率各为84.11%、76.37%, 分别高于其在接种后给药21d 的抑瘤率(46.37%), 证明仙人掌提取物对肿瘤早期发生具有较好的抑瘤作用6。资料表明仙人掌的果实提取物能抑制宫颈癌、卵巢癌和膀胱癌细胞的增殖, 而且能抑制患有卵巢癌大鼠的肿瘤生长; 仙人掌对肿瘤细胞生长的抑制作用与加速癌细胞凋亡和使癌细胞在G1 期停留时间延长有关, 也可能是通过抑制肿瘤生长的p53 途径7。另有研究表明, 仙人掌抑制肿瘤生长的作用与现用于卵巢癌预防的药物N(4-氨基苯酚)维甲酰胺(4-HPR)作用相当。仙人掌中的黄
10、酮类化合物能增加细胞内钙池钙离子浓度, 并干扰与人T 细胞S 期转换有关的白介素-2的表达, 这是否与仙人掌对肿瘤细胞的抑制作用有关, 目前正在研究。82实验设计2.1 材料2.1.1研究对象：食用仙人掌2.1.2 实验对象：HL-60细胞2.1.3实验仪器：CO培养箱（SANYO电子科技有限公司）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS-CKX41,OLYMPUS U-RFLT50）、净化工作台（济南杰康净化设备厂）、1640培养基（上海英骏生物技术有限公司）、高速冷冻式离心机（TGL-16G-A）、实验室超纯水器（EPED-30TH，上海蓝季科技发展有限公司）、立式压力蒸汽灭菌器（LS-B50L-
11、I）、Multiskan MK3酶标仪（赛默飞世尔仪器(上海)有限公司）、800型离心沉淀器（上海手术器械厂）、KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、8401-I型远红外高温干燥箱（杭州中拓仪器有限公司）、恒温加热磁力搅拌器（CL-Z型，郑州长城科工贸有限公司）、旋转蒸发仪（RE52CS,上海亚荣生化仪器厂）、恒温水浴锅（B-220，上海亚荣生化仪器厂）、循环水式真空泵（SHZ-DC,G巩义市子华仪器有限责任公司）、微型枪（10、50、100、150、200、250、400、600、800、1000）、薄层层析用硅胶GF254, 批号20001226, 粒度范围200
12、目以上,青岛市北区海化干燥剂厂生产; 紫外分光光度计、电热套、圆底烧瓶、蛇形冷凝管、布氏漏斗、分液漏斗、分析天平、容量瓶、量筒、烧杯、胶头滴管、移液管、比色管2.1.4 实验试剂： Sigmo MTT试剂、台盼蓝染液、1640培养液、乙醇、氯仿、甲醇、1 mol / L 的硫酸,、浓氨水、改良碘化铋钾试剂、酪胺标准溶液、KB r 粉末2.2方法2.2.1仙人掌中生物碱的提取分离与精制 将仙人掌粉碎，取细粉20g，在条件为：乙醇浓度95 % 、物料比115 、提取温度50 、提取时间3 h的条件下，乘热抽滤，滤渣再于同一条件下提取2h，乘热抽滤，合并滤液，滤液减压浓缩，再将滤液放冷析出结晶，得粗
13、提物。向粗提物中加入适量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 滤去酸水液中的沉淀, 加入适量的浓氨水调至pH 值9 10 。然后加氯仿用分液漏斗萃取3-4。后,取氯仿层用旋转蒸发仪进行浓缩后抽滤，得总生物碱。2.2.2仙人掌中生物碱类物质的鉴定2.2.2.1化学法检查 将提取的总生物碱液，用1%的盐酸萃取，得盐酸溶液10毫升，分为四个小试管储存，分别在四个小试管中加入改良碘化铋钾、碘-碘化钾、碘化汞钾、硅钨酸试剂，观察各试管中的变化，记录在如下表格中。2.2.2. 2.薄层层析检查取总生物碱少许氯仿丙酮甲醇（611）溶解, 用毛细管点样于预先制备好的硅胶GF254 板上, 上行法展开。当展开剂跑至硅胶板前沿约1 2 cm 处时, 取出, 挥干溶剂。先观察荧光, 后用改良碘化铋钾试剂喷雾显色,观察斑点位置及颜色，同时用酪胺标准品作对照。2.2.3 白血病HL-60细胞培养人早幼粒白血病细胞HL-60培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，加青霉素100gmL-1，链霉素100gmL-1，置于5% CO2，37饱和湿度恒温箱
