《《农杆菌介导棉花转基因的方法》-公开DOC·毕业论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《农杆菌介导棉花转基因的方法》-公开DOC·毕业论文（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 河南大学2012届本科毕业论文 农杆菌介导棉花转基因的方法论文作者姓名： 作 者 学 号：0803632010 所 在 学 院：河南大学民生学院所 学 专 业：生物技术 导师姓名职称： 教授 论文完成时间：2012年5月7日 2011年5月10日目录摘要41 前言41.1植物转基因的意义41.2棉花转基因常用的方法41.2.1基因枪法51.2.2 PEG法51.2.3显微注射法、电击法及激光法51.2.4花粉管通道法61.2.5农杆菌介导法61.3植物耐盐相关的SOS2 基因91.3.1SOS2 基因的定位克隆91.3.2SOS2 编码一个假定的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶91.4农杆菌介导棉花
2、的作用102 供试材料102.1棉花的胚性愈伤102.2介导菌种103 方法与结果103.1实验方法103.1.1平板划线103.1.2菌落PCR鉴定113.1.3小摇123.1.4大摇123.1.5集菌123.1.6重悬133.1.7农杆菌侵染与共培养133.1.8抗性愈伤筛选143.2抗性愈伤组织的鉴定（结果）143.2.1愈伤组织DNA的提取143.2.2扩PCR与电泳分析154 农杆菌介导的讨论154.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理154.2农杆菌菌株和质粒要求164.3 Ti载体容量165 结束语16参考文献17Abstract19致谢信20农杆菌介导棉花转基因的方法左耳东（河南
3、大学民生学院 2008级生物技术专业 开封 475004）摘要：SOS2 基因编码一个446氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究发现，拟南芥受盐胁迫时，质膜上钠氢转运蛋白SCaBP8蛋白的活性增强，受了SOS2磷酸化的调节，增加植株耐盐性。本文通过GV3101农杆菌介导的转化方法，将SOS2基因转入棉花茎尖愈伤组织，繁育成苗，获得转基因棉花，以期熟练掌握农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织的方法。结果显示，通过农杆菌介导得到的抗性愈伤组织，经过提取DNA、PCR扩增、电泳分析，确定得到具有耐盐性基因的棉花愈伤组织，成功运用了农杆菌介导SOS2基因转入棉花愈伤组织。关键词：棉花转基因 农杆菌介
4、导转化 愈伤组织 SOS2基因1前言1.1植物转基因的意义 自从1984年首次获得转基因烟草1以来, 植物转基因技术日益得到广泛的应用, 它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。在基础研究上, 对于植物基因的表达与调控、分子元件的鉴定与利用2等, 植物基因转化技术无疑是一个有利的研究工具在改良农艺性状上, 它可以大大缩短育种年限, 加快育种进程3,4;更为重要的是,植物基因转化打破了物种间基因交流的界限, 目的基因的来源极为广泛, 不仅可以来自不同的植物物种, 还可以来自动物、微生物包括真菌等等。多年以来, 人们一直利用它来改良植物的农艺性状, 如使植物获得抗病性、抗虫性、抗逆性以
5、及提高产量、改善品质等等。此外, 还有人利用转基因技术来创造雄性不育系5、生物反应器4等。1.2棉花转基因常用的方法1.2.1基因枪法基因枪法，是1987 年由美国康奈尔大学的Sanford 提出的一种直接基因导入法,这种方法是借高速运动的金属粒将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞,然后通过组织培养再生出完整植株。由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程,因此它具有不用原生质体再生培养、受体材料来源广泛、不受基因型限制、缩短了获得转基因植株的周期、获得的转基因植株变异率低、通常具有正常的育性等优点6。但是基因枪法也有自身的缺点:转化效率不高,大多在0. 11. 0 %的范围内,难以选
6、择;外源基因序列常是多拷贝插入,从而导致基因沉默;转入的基因有时是呈非孟德尔遗传; 费用较高等7。1.2.2PEG法PEG法是一种通过化学物质PEG(聚乙二醇) 处理去壁的原生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化。Krens等首次通过此法在烟草中获得成功。但是此法具有明显的缺点:原生质体培养再生难度较大;受基因型限制;原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白化苗;转化率低7 。1.2.3显微注射法、电击法及激光法显微注射法(microinjection) 是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中,通过组织培养最终获得转化植株。此项技术起初主要应用于动物,八十年代中期开始
7、应用于植物的遗传转化。虽然该法具有DNA 注射的准确性、预见性、克服远源杂交的困难等优点,但其又有工作效率低、表达不稳定等缺点,故其应用受到了限制。电击法(elect roporation) 是八十年代初发展起来的一种转化技术,首先在原生质体上运用此法将CAT 基因(氯霉素乙酰转移酶基因)转移到烟草、胡萝卜、玉米等植物的原生质体中并得以表达8。此法的主要原理是在高压脉冲条件下,细胞膜上会出现瞬时可逆性开放小孔,为外源物质提供了通道,借此导入DNA 等遗传物质,达到转化的目的。激光法同电击法类似,一定波长的激光聚焦后直径达0. 30. 5 微米时,高能量的激光束可引起细胞膜的可逆性穿孔,短时间内
8、又可自动修复。激光法和电击法均可用于双子叶和单子叶植物,转化受体材料广泛。1.2.4花粉管通道法花粉管通道法(pollen - tube pathway) 又称子房注射法(overy injection) ,是将外源DNA 注入到子房中轴的胎座位置,经形成的花粉管胚囊,转化受精卵或胚细胞。这是一种在整体植株水平上的转化方法,可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上进行,免除了细胞和组织培养程序,并可直接获得转化的种子,开创了整株活体基因转化的新途径。不过这种方法看似简单但操作要求极为严格9。1.2.5农杆菌介导法农杆菌是一种革兰氏染色阴性菌,普遍存在于双子叶植物中。农杆菌属共分为四个种,即根癌农
9、杆菌、毛根农杆菌、放射性农杆菌、和旋钩子农杆菌。目前研究较多的是根癌农杆菌(agrobac2terium tumefaciens AT) 和毛根农杆菌( agrobac2terium rhizogenes AR) ,它们都可以浸染植物细胞,但引起不同的病症,根癌农杆菌常引起植物近地面的根茎交界处形成帽状的肿瘤。科学家们经过长期的研究发现,农杆菌中存在一种环状的、大小约150 200kb 的质粒( tumor2inducing plas2mid ,简称为Ti 质粒) ,植物肿瘤即是有Ti 质粒上的一段DNA 引起的,它通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基因组中并表达,从而引起肿瘤的发生,
10、这段DNA 称为T - DNA(t ransferredDNA)，是一种天然存在的遗传转化体系。人们利用这种遗传转化体系将外源基因导入植物细胞,并利用植物细胞的全能性,通过组织培养,由一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株,此即农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium2medi2ated t ransfermation)9 。农杆菌Ti 质粒的T -DNA 中带有Onc基因(致癌基因) ,它在植物细胞内编码植物生长素和细胞分裂素,使受浸染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。此外T - DNA还编码Opine 类化合物,作为农杆菌代谢的氮源和碳源。Ti 上的T2DNA 是由两端两个不完整的
11、25 个碱基对的顺向重复序列所界定,由于T -DNA 不含编码促使自身转移物质的基因,故可将其上的Onc基因及其它不必要的序列去掉,而插入要转化的目的基因序列,从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的9。自1983 年利用农杆菌转化获得首例转基因烟草以来,农杆菌介导的基因转化重要环节已形成了相当成熟的实验流程,在油料、糖料、纤维、花卉、果树、蔬菜、林木、谷类等植物中均获得了转基因植株。据统计至今获得的转基因植株中80 %以上是农杆菌介导转化法获得的8 。农杆菌转化的具体操作方法也多种多样,如直接感染植物伤口法、叶盘法、原生质体共培养法、真空容器中浸染完整植株10、愈伤组织共培养等。由于单子
12、叶植物不是农杆菌的天然寄主,农杆菌介导的遗传转化在水稻、小麦、玉米等主要农作物上的应用一度曾非常缓慢,但自1994 年首先在水稻上取得了重要突破以来11 ,在小麦、玉米等粮食作物中相继取得了成功,显示了利用此法改良主要农作物品种的巨大潜力。农杆菌介导法与其它方法相比较具有许多优点:操作简便不需特殊仪器,培养周期短;技术最成熟,转化效率高;外源基因多以单拷贝插入,稳定性好;可以利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行特异表达;较少出现基因沉默现象9 ,12 ;可将较大片段DNA 完整地转移到植物基因组中等10 ,13。不过由于T - DNA 可以在植物染色体的任何区域内插入,就有可能导致有益
13、基因的插入失活,因此外源基因插入问题尚有待于基因转移技术的进一步完善12。特别是在禾本科粮食作物的遗传转化方面还存在许多局限9。1.2.5.1农杆菌Ti 质粒基因组分区Ti 质粒是农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合环状DNA 分子,大小约200250 kb。依据Ti 质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根瘤农杆菌或Ti 质粒可分为4 种类型:章鱼碱型(Octopine) 、胭脂碱型(Nopaline) ,农杆碱型(A2gropine) 和琥珀碱型(Succinamopine) 。原始的Ti 质粒根据其功能的不同,可分为4 个区:(1) T - DNA 区( Transfer - D
14、NA region) :不同来源的菌株, T - DNA 的长度在1224kb ,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA ,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T - DNA 本身的转移与整合无关。T- DNA 上最重要的是T - DNA 区两端的边界各为25bp 的重复序列。其中14bp 是完全保守的, 分10bp (CAGGAATATAT) 和4bp ( GTAA) 不连续的2组。左右2 个边界(LB 和RB) 是T - DNA 转移所必需的,只要其存在, T - DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中,转移的方向是从右向左,T - DNA
15、 的右边界在T - DNA 的整合中对于靶DNA 位点的识别具有重要作用14 ,因此,尤以右边界更为重要。(2) 毒性区(Virulence region ,vir区) :位于T -DNA 以外的1 个3040kb 的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T -DAN 的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因( vir) 。目前,对章鱼碱型农杆菌Ti 质粒p Til5955 和胭脂碱型农杆菌Ti 质粒p TiC58的vi r 区进行了全序列分析，在章鱼碱型Ti 质粒发现了8 个操纵子,分别为virA - virH ,共包括23 个基因( virA , virB1virB11 , virC1 , virC2 ,virD1 virD4 , virE1 , vi rE2 , virF , virG , virH) 。而胭脂碱型Ti 质粒的vir 区不含virF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs15。也有学者认为有大约35 个vir 基因成簇排布于vir 区16。(3) 接合
