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1、 学号：2008xxxxxxx潍坊医学院本科生毕业论文（设计）题 目：三叶因子蛋白在毕赤酵母GS115中高效表达 姓名xxx专业xxx年级、班级2008级部、系(院)xxxxx指导教师姓名专业技术职务xxx 副教授2012 年 6 月 4 日目 录中文摘要1英文摘要21引言 32材料 42.1材料 42.2主要仪器 53方法 63.1构建重组质粒 63.2工程菌株在试管中的培养 63.3诱导培养 63.4 SDS-PAGE电泳检测重组蛋白 73.5筛选高效表达菌株84结果 94.1三叶因子蛋白表达菌株的筛选 94.2三叶因子蛋白的诱导表达 95讨论116结论 13参考文献 14附图表 15综述
2、 17致谢 21w摘 要目的：三叶因子蛋白在巴斯德毕赤酵母菌株GS115中摇瓶培养并甲醇诱导表达，筛选出三叶因子蛋白高效表达的菌株。 方法：以pPICZ为载体，构建三叶因子蛋白真核表达质粒，经SacI 线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布MD平板，得到70个转化子。分别接种到试管中恒温摇动培养24h，再接种到摇瓶BMGY培养基中振荡培养36h，最后转接到BMMY培养基，诱导培养96h，分别在培养24h、48h、72h和96h四个时间点补加甲醇进行诱导表达，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，从而筛选出三叶因子蛋白高效表达的菌株。筛选出的工程菌株经上述方法诱导培养，摸索三叶因子
3、蛋白在毕赤酵母GS115诱导表达的最适时间。结果：离心培养液，收集上清进行SDS-PAGE电泳，电泳图谱上能清楚的看到目的蛋白表达条带。结论：三叶因子蛋白在巴斯德毕赤酵母菌株GS115获得高效表达。并筛选出高效表达三叶因子蛋白的工程菌株，为对三叶因子蛋白进一步功能研究奠定了基础。关键词：巴斯德毕赤酵母菌株GS115；三叶因子蛋白；甲醇；SDS-PAGE电泳。AbstractObjective: Trefoil factor protein in Pichia pastoris yeast strain GS115 shake flasks and methanol induction, scr
4、eening out high-level expression of trefoil factor protein strains.Methods: To pPICZ trefoil factor protein eukaryotic expression plasmid, the SacI linearized power into Pichia pastoris GS115 competent cells coating the MD plates, 70 transformants. Were inoculated with cultured 24h thermostatic shak
5、ing the test tube, and then inoculated into a shake flask BMGY medium in shaking culture 36h, and finally transferred to BMMY medium for induction 96h, respectively, in cultured 24h, 48h, 72h and 96h four Dianbu plus methanol inducible expression of target protein expression by SDS-PAGE electrophore
6、sis, which screened the strains of high-level expression of trefoil factor protein. Filter out the engineering strain induced by the above method to culture, explore a trefoil factor protein expression in Pichia pastoris GS115 induced optimal time.Results: Centrifugal medium supernatant was collecte
7、d for SDS-PAGE electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis can clearly see the target protein bands.Conclusion: Trefoil factor protein was highly expressed in Pichia pastoris yeast strain GS115. And filter out the high expression of trefoil factor protein engineering strains, laid the founda
8、tion for further functional studies of trefoil factor protein.Key words: Pasteur Pichia yeast strain GS115; Trefoil factor protein; Methanol; SDS-PAGE electrophoresis.1 引 言巴斯德毕赤酵母1 ( Pichia pastoris )是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。巴斯德毕赤酵母能在多种培养液中生长2，如无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源等。巴斯德毕赤酵母表达系统具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统
9、,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点，以及表达量高、稳定性高、分泌量高和自身分泌蛋白少、糖基化程度低、廉价而无毒等优点。从而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在巴斯德毕赤酵母中得到表达。巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景3。三叶型家族4 (trefoil factor family, TFFs)蛋白通过增强细胞迁移，促进细胞增殖, 对抗细胞凋亡等过程参与黏膜的修复，并维持其完整性。除此而外，TFFs也涉及到肿瘤的发生或肿瘤的抑制。人TFF2又名解痉孪多肽，在胃肠道的伤口修复，上皮再生和抗感染等过程中，通过促进细胞迁移和抑制细胞凋亡发挥作用，并且TFF2表达的增
10、加常常与肿瘤的进展和不良的预后相关。从大蹼铃蟾皮肤分泌物中纯化得到的含两个三叶因子结构域的Bm-TFF2，是第一个被报道的具有整合素IIb3依赖性血小板活化活性的三叶因子蛋白质5。最近的研究又表明，天然Bm-TFF2具有促进细胞迁移、细胞增殖以及抗凋亡的功能6，而这些可能与其促进伤口修复、组织再生功能紧密相关(Zhang etal)。所以，Bm-TFF2潜在的生物学活性使其成为一种有用的分子工具来进一步研究TFFs家族蛋白结构与功能的关系，有待我们去研究。因此，本实验通过真核表达载体pPICZ将外源基因三叶因子整合进入巴斯德毕赤酵母菌株GS115，并在甲醇为唯一碳源的培养基下诱导培养，使其在巴
11、斯德毕赤酵母外源表达系统中高效表达，筛选出高效表达的工程菌株，并确定最适合的诱导温度和最适宜的诱导时间。2 材料2.1 材料2.1.1 诱导培养相关材料及培养基的配制(1) 主要试剂：酵母粉、蛋白胨、甘油、生物素、YNB(酵母氮源碱)、甲醇、1M磷酸缓冲溶液pH6.0、蒸馏水等。(2) BMGY培养基：用电子天平准确称取酵母粉1.0 g；蛋白胨2.0 g，0.1 mol/L Ph 6.0磷酸缓冲液，甘油1.0 mL，加蒸馏水到100 mL，410-5 g生物素，10 mL 10YNB (酵母氮源碱)。(3) BMMY培养基：用电子天平准确称取酵母粉1.0 g；蛋白胨2.0 g；410-5 g生
12、物素，0.1 mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，加蒸馏水到100 mL，10 mL YNB（酵母氮源碱)，甲醇0.5 ml。(4) YNB：用电子天平称取13.4 g YNB溶于100 mL蒸馏水，加热溶解，过滤除菌，4冰箱保存。(5) 10GY (10%甘油)：将100 mL甘油与900 mL去离子水混合，高压灭菌，4冰箱保存备用。2.1.2 SDS-PAGE缓冲液及蛋白含量测定相关溶液的配制(1) 主要试剂：丙烯酰胺(Acr)、亚甲双丙烯酰胺(Bis)、Tris、Tricine、SDS、甘氨酸、-疏基乙醇、考马斯亮蓝R250、甲醇、去离子水、浓盐酸、过硫酸铵、尿素；冰醋酸；超纯水等。(2
13、) 30% 聚丙烯酰胺：用电子天平称取丙烯酰胺29.0 g和甲叉双丙烯酰胺1.0 g加去离子水定容到100 mL，4冰箱避光保存。(3) 10阳极缓冲液(pH 8.9) (外)：用电子天平准确称取Tris 24.23 g加去离子水，溶解后用盐酸调整pH至8.9，用去离子水定容到100 mL，4冰箱保存。(4) 10阴极缓冲液(pH 8.25) (内)：用电子天平准确称取Tris 12.1 g，Tricine 17.9 g，SDS 1.0 g，加去离子水，溶解后用盐酸调整pH至8.25，用去离子水定容到100 mL，4冰箱保存。(5) 胶缓(pH 8.45)：用电子天平准确称取Tris 12.1 g，SDS 0.1 g，加去离子水定容到100 mL，4冰箱保存。(6) 1.5M Tris-HCl (pH 8.8)：用电子天平准确称取Tris 18.17 g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100 mL。(7) 1M Tris-HCl (pH 6.8)：用电子天平准确称取Tris 12.11 g加ddH2O溶解，浓盐
