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1、第1课时微生物的分离和培养学习导航1.简述高压蒸汽灭菌锅的使用方法及注意事项。2.掌握制备细菌培养基的方法。3.学会利用无菌操作技术接种与培养大肠杆菌。重难点击1.培养基的配制方法及常见种类。2.大肠杆菌的接种与分离培养。一、微生物分离和培养的基本理论1.无菌操作技术实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。(1)干热灭菌方法是将拟灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在160170 温度下加热12 h以达到灭菌的目的。(2)湿热灭菌方法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，如手提式高压蒸汽灭菌锅就是实验室常用的灭菌仪器之一。高压蒸汽灭菌锅的使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步
2、骤。2.配制培养基(1)培养基概念：为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。(2)培养基类型天然培养基：采用动植物组织或微生物细胞以及它们的提取物或粗消化物配制而成，如牛肉膏蛋白胨培养基。优点：取材便利、营养丰富、配制简便；缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。合成培养基：由准确称量的分析纯等级别的高纯度化学试剂加蒸馏水配制而成，如葡萄糖铵盐培养基。优点：化学成分及其含量明确、实验的可重复性好；缺点：配制繁琐、成本较高。(3)培养基成分：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等最基本的物质。(4)培养基的配制原则：在配制培
3、养基时，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的pH使之满足微生物生长的需要。3.接种微生物(1)接种的概念：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。(2)常用的接种工具：玻璃涂布器、接种针、接种环等。(3)接种方法用接种针进行穿刺接种。用接种环进行斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种。用玻璃涂布器进行涂布平板接种等。1.“无菌操作”与人们的生活休戚相关，无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健康防护中，有哪些“无菌操作”的例子？答案日常生活、生产实践、自身健康防护中“无菌操作”的例子分别有：(1)被褥、鞋袜要常晒；肉制品储存时用盐腌等。(2)
4、家畜阉割后，要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒；初冬杨树树干涂刷生石灰水等。(3)打针时，注射部位要用酒精棉球擦洗，一般要在其伤口处涂抹一些碘酒。2.实验室常利用高温处理达到灭菌效果，包括采用干热灭菌或湿热灭菌等方法。以下图高压蒸汽灭菌锅的使用为例，探究无菌技术的方法。(1)高压蒸汽灭菌的使用原理是什么？答案使用原理：将待灭菌物品放在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内；把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭；再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100 以上。(2)简述手提式高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。答案加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等。(3)消毒和灭菌的原
5、理是什么？消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？是否适用于所有的生物和物品？答案都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅能杀死物体表面或内部的部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。不是，无菌技术既要考虑效果，又要考虑操作对象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的双手等只能消毒，而不能灭菌。(4)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？答案还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。3.微生物的培养离不开培养基，根据下面某微生物培养基的配方回答下列问题：成分含量NaNO33 gK2HPO41 gKCl0
6、.5 gMgSO47H2O0.5 gFeSO40.01 gC6H12O630 gH2O1 000 mL青霉素0.1万单位(1)该培养基的碳源、氮源分别是什么？答案碳源：C6H12O6；氮源：NaNO3。(2)依据物理性质用途划分，该培养基属于什么培养基？答案依据物理性质划分，该培养基属于液体培养基；依据用途划分，则属于选择培养基。根据培养基的原料，所培养微生物的同化作用的类型是异养型，培养的微生物可能是酵母菌或霉菌。(3)在固体培养基中加入的琼脂能为微生物提供营养吗？为什么？答案不能，微生物不能分解琼脂。(4)普通培养基能培养病毒吗？为什么？答案不能，因为病毒只能进行活细胞寄生生活。整合提升(
7、1)消毒与灭菌的区别项目条件结果常用的方法消毒较为温和的物理学或化学方法仅杀死物体上绝大多数微生物(包括病原微生物和有害微生物的营养细胞)煮沸消费法(在100 下56 min可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢)、巴氏消毒法、化学药剂消毒法灭菌强烈的物理学或化学方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌(2)培养基的成分及功能营养要素含义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮
8、的代谢产物无机氮源：NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子(特殊营养物质)生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定培养基、大气、代谢产物等无机盐为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂培养基、大气等环境1.高温灭菌的原理是()A.每种微生物生长的最适温度是一定的B.微生物对于高温环境不适应C.高温破坏了微生物细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动D.高温降低了环境中氧的浓度
9、答案C解析高温的致死作用主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子物质发生不可逆转的变性。2.下列关于培养基的说法正确的是()A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B.培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C.除水以外的无机物只能提供无机盐D.无机氮源不可能提供能量答案A解析根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。方法链接培养基的种类分类标准培养基种类培养基特点
10、作用物理性质固体培养基外观固态微生物的分离、计数等半固体培养基容器放倒不致流出，剧烈振动则破散观察微生物的运动、鉴定菌种等液体培养基呈液态常用于工业生产功能选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长选择、分离鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴定成分来源天然培养基化学成分还不清楚工业上大规模的微生物发酵生产合成培养基化学成分完全了解在实验室用来对微生物分析二、大肠杆菌的接种与分离培养1.配制牛肉膏蛋白胨培养基2.斜面接种和培养大肠杆菌斜面接种大肠杆菌的主要目的有菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。具体操作步骤：3.平板划线分离和培养大肠杆菌
11、在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板制作配制好的培养基装瓶灭菌倒平板操作(A.打开瓶塞B.灼烧瓶口灭菌C.倒培养基D.倒置平板)。(2)平板划线分离与培养大肠杆菌平板划线法的含义：用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。注意事项：接种和划线操作时需要在酒精灯火焰附近进行。1.利用培养基培养微生物时，首先要把微生物接种到培养基上。以牛肉膏蛋白胨培养基的配制为例，完成下列有关问题：(1)以下为细菌培养基的配制的流程，若将分装步骤与调节pH步骤颠倒过来是否可行？答案不行。若分装后再调节pH，会使培养基中pH调节不均匀
12、；还可能将培养基弄到试管口，易被污染。(2)从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？答案平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。2.斜面接种和培养大肠杆菌(1)下图接种方法分别是什么？答案图1是穿刺接种、图2是斜面接种、图3是平板划线接种。(2)下表是关于接种操作步骤及其目的或分析说明，请完善下表。顺序接种操作步骤分析说明或目的将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红将接种环灭菌，避免污染菌种在火焰旁冷却接种环，拔去试管棉塞避免杂菌污染菌种将试管口通过火焰灼烧灭菌
13、，防止试管口菌体污染培养基将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触斜面顶端使接种环冷却，避免杀死菌种抽出接种环时，带菌部分不要触及管壁或通过火焰防止菌种沾于管壁，防止菌种被杀死在培养基斜面上由底部向上轻轻划“S”型曲线，但不要将培养基表面划破初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准将试管口与试管塞通过火焰23次，迅速塞紧试管防止杂菌污染将接过种的试管，放在恒温箱(37 )中培养24_h培养细菌，观察接种和培养的结果3.平板划线分离和培养大肠杆菌在实验室中，平板常常被用来培养、分离细菌等微生物。思考回答下列相关问题：(1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？答案接种前
14、将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答案避免接种环温度太高，杀死菌种。(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？答案操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成。(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答案需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答案划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。(6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？答案最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，达不到纯化的效
