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1、ceRNA机制及研究方案介绍 1 目录 2 miRNA作用方式 3 RNA和miRNA作用方式 4 RNA miRNA 1对多 多对1 多对多 ceRNA的逻辑关系 5 ceRNA假说 competitiveendogenousRNA 竞争性内源RNA 共享miRNA结合位点的转录本会竞争性结合相同的miRNA ceRNA机制的生物学功能 RNA转录本通过与编码RNA竞争性的结合microRNA 从而稀释掉细胞内游离microRNA的浓度 降低microRNA对编码RNA的抑制 进而提高目的基因的表达量 6 ceRNA的种类 7 ceRNA部分研究结果 8 ceRNA的国自然面上项目申请状况
2、9 10 ceRNA的课题申请状况 ceRNA的方案设计 ceRNA关系对的获取及基本qPCR分析 ceRNA关系对中各成分与疾病相关性验证 ceRNA关系对中的竞争性关系的验证 11 12 ceRNA关系对的获取 13 ceRNA的验证试验 LncRNA为例 实例分享一 LncRNApagbc对miRNA的海绵调控作用促进胆囊肿瘤发生 WuX WangF LiH etal LncRNA PAGBCactsasamicroRNAspongeandpromotesgallbladdertumorigenesis J EmboReports 2017 IF8 568 高通量测序 qPCR验证 Ln
3、cRNA功能验证 14 文献一技术路线 15 目的LncRNA的确定 高通量测序LncRNA miRNA测序 9对胆囊癌与癌旁组织选取5条LncRNA在26对癌与癌旁组织进行qPCR验证构建lncRNA PAGBC mRNA的基因共表达模型 16 目的LncRNA的确定 验证LncRNA PAGBC在大样本中的表达在60个癌与癌旁组织中进行lncRNA PAGBC表达量的统计分析 证明lncRNA PAGBC与癌症的相关性 17 目的LncRNA的确定 对77个病例进行关于lncRNA PAGBC的生存分析 对lncRNA PAGBC进行两个细胞系中进行亚细胞定位 18 目的LncRNA的确定
4、 在胆囊癌细胞系 GBC NOZ 中进行lncRNAPAGBC沉默 分析细胞增殖及裸鼠成瘤 19 目的LncRNA的确定 在胆囊癌细胞系中进行lncRNAPAGBC过表达 分析癌细胞的迁移 侵袭和成瘤能力 20 LncRNA PAGBC的与miRNA关系对确定 整合LncRNA与miRNA数据 预测出PAGBC的6条靶miRNA选用双荧光素酶报告系统进行关系对验证 293T细胞 NOZ细胞 21 LncRNA PAGBC的靶基因确定 结合miR 133b miR 511靶基因预测以及篇首的高通量数据 推测出靶基因SOX4和PIK3R3癌细胞中分别转入LncRNA PAGBC的突变体 分别针对m
5、iR 133b miR 511结合位点 后 进行靶基因表达检测 22 LncRNA PAGBC的目的基因确定 癌细胞中分别转入LncRNA PAGBC的突变体 过表达 miRNAinhibitor miRNAmimic 进行靶基因表达检测 23 结论 通过高通量测序发现与胆囊癌相关的特定LncRNA 经过在病例中的检测初步筛选出目的LncRNA 沉默 过表达LncRNA在体内及体外的功能试验 验证出LncRNA PAGBC与胆囊癌细胞的增殖有关系 通过生信分析从LncRNA PAGBC预测出6个靶miRNA中 通过体内 体外试验确定出其靶标miR 133b miR 511 LncRNA PAG
6、BC通过竞争性的与miR 133b miR 511结合 促进SOX4和PIK3R3表达升高 进而活化了AKT mTOR通路 24 lncRNAHOTAIR在肾癌细胞中通过miR 217调节HIF 1 Axl信号途径高通量测序 qPCR验证 LncRNA功能验证 QuanH OuL WeiZ etal LncRNAHOTAIRregulatesHIF 1 AXLsignalingthroughinhibitionofmiR 217inrenalcellcarcinoma J CellDeath Disease 2017 8 5 e2772 IF5 965 25 实例分享二 研究路线 26 皮肤黑
7、色素瘤中的竞争性内源RNA调控分子机制高通量测序 qPCR验证 circRNA功能验证XuS JingS ShengY etal IntegrativeanalysisofcompetingendogenousRNAnetworkfocusingonlongnoncodingRNAassociatedwithprogressionofcutaneousmelanoma J CancerMedicine 2018 8Suppl IF3 362 27 实例分享三 方案设计 测序 qPCR 15W IF 4分左右 功能试验 15 25W IF 3 5分左右 测序 qPCR 功能试验 35 40W IF 6 8分 28 SalmenaL PolisenoL TayY etal ceRNAhypothesis TheRosettaStoneofahiddenRNAlanguage J Cell 2011 146 3 353 8 ThomsonDW DingerME EndogenousmicroRNAsponges evidenceandcontroversy J NatureReviewsGenetics 2016 17 5 272 29 参考文献 感谢聆听 欢迎交流学习 30
