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1、第8课时固定化酶的制备和应用学习导航1.阅读教材P42内容，了解固定化酶的常用方法。2.结合教材P4041内容，学习固定化乳糖酶的制备。3.结合教材P4243内容，检测牛奶中乳糖的分解。重难点击1.尝试制备固定化乳糖酶。2.利用固定化酶检测乳糖的分解产物。一、固定化酶及其制备由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。利用固定化酶技术可以解决这些难题。1.固定化酶(1)概念：固定化酶又叫固相化酶，是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。酶的固定化过程是通过化学或物理的手段，将酶束缚在一定的区间内，固定酶分子在此区间内进行催化作用。(2)酶的固
2、定方法：根据酶的性质和载体特性需要采用不同的方法，有时还需要将几种方法联合使用：是吸附法：是将酶吸附到载体表面。是载体偶联法：是将酶通过共价键结合到载体的表面。是交联法：通过把酶交互连接、相互结合从而将酶固定。是包埋法：是将酶或者细胞包埋在细微的网格里。(3)固定化酶技术的优缺点优点：稳定性好，而且与底物和产物容易分离。缺点：一次只能固定一种酶，不利于催化一系列的反应。2.固定化乳糖酶的制备(1)实验原理乳糖酶学名为D半乳糖苷水解酶，是工业中应用相当广泛的一种酶，较多地应用于乳制品加工中。很多人小肠黏膜内的乳糖酶活性严重降低，导致乳糖不耐症。用乳糖酶处理部分乳糖，分解为葡萄糖和半乳糖，可以减少
3、这种症状。固定乳糖酶用的是凝胶包埋法：凝胶是由丙烯酰胺(Arc)和N，N甲叉双丙烯酰胺(Bis)形成的三维网状结构的高聚化合物，将酶和凝胶混合，酶即包埋在凝胶内部的微孔中，从而将酶固定。(2)方法步骤乳糖酶的溶解：准确称取乳糖酶100 mg，然后将其溶解在pH7.3的磷酸缓冲液中，其中单体Arc浓度为质量分数20%，交联剂Bis浓度为质量分数5%。聚合：将含有0.6 mL N，N，N，N四甲基乙二胺和200 mg过硫酸铵的4 mL磷酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀，4 条件下进行聚合反应30 min。漂洗：聚合反应完成后形成凝胶，用小刀切成小块，用缓冲液洗涤46次，04 保存备用
4、。1.固定化酶依据的原理与其优点分别是什么？答案将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。2.固定化乳糖酶的制备(1)制备固定化乳糖酶时为什么要用缓冲液配制凝胶单体？答案酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液配制凝胶单体能保持溶液中pH的相对稳定，从而保证实验过程中酶的活性。(2)漂洗凝胶的目的是什么？答案将凝胶表面没有固定的乳糖酶冲洗干净。归纳总结固定化酶及其制备的2点总结(1)固定化酶的优点同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；
5、可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型。(2)固定化乳糖酶时的注意事项乳糖酶溶解时为了保持酶的活性，需使用磷酸缓冲液。缓冲液反复冲洗一方面针对形成凝胶后表面还有一些酶没有包埋在凝胶内部的微孔中被冲洗掉，另一方面维持酶的活性。Arc和Bis都是神经性毒剂，操作过程中注意不要沾到皮肤上和吸入体内，一旦沾到皮肤上要立即用水冲洗。聚合反应和试剂的质量有很大的关系，如果在教材规定的时间内还没有聚合完成，可以适当延长聚合时间。1.下列关于固定化乳糖酶的制备的说法，不正确的是()A.在乳糖酶的溶解中加入磷酸缓冲液是为了维持pH相对稳定，保证乳糖酶的活性B.聚合过程中应将混有各种物质的磷
6、酸缓冲液迅速倒入乳糖酶的溶解液中，缓慢搅拌混匀C.聚合过程中各种物质就放在40 进行聚合反应30 minD.漂洗过程中用磷酸缓冲液洗涤46次，将其表面没有固定的酶冲洗掉，04 保存备用答案C解析固定化乳糖酶的制备过程中始终都应该是用缓冲液来维持pH的相对稳定，以保证酶不会变性失活，而对于聚合反应形成凝胶的过程中应该在温度为4 条件下进行，而不是40 。2.下列属于固定化酶应用特点的是()可以被反复利用有利于酶与产物分离能自由出入载体一种固定化酶只催化一种酶促反应酶多用包埋法固定化A. B.C. D.答案C解析酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体。通常情况下固定化酶种类
7、单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应。酶分子较小，不适合采用包埋法进行固定化。一题多变(1)在实际生产中，固定化酶技术能节约成本的原因是什么？答案固定化酶能被反复利用。(2)写出如图所示固定化酶的方法。答案是交联法，是吸附法，是包埋法。二、固定化酶的应用固定化酶在工业生产和医学等方面有着重要的用途，下面我们就利用固定化酶来检测牛奶中乳糖的分解。1.实验原理乳糖酶可以将牛奶中的乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，还原糖可和斐林试剂反应产生砖红色化合物，根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性。2.方法步骤(1)鲜牛奶的处理：取新鲜牛奶0.5 kg放入1 000 mL干净烧杯
8、中，8590 巴氏灭菌。将灭完菌后的牛奶冷却至4550 ，过滤后平均分为两部分，一部分放入A烧杯，另一部分放到B烧杯内作对照。(2)加酶分解：向A烧杯内加入适量的固定化酶制剂，4550 条件下保温45 min，保温过程中要用预先灭过菌的玻璃棒每隔一段时间轻轻搅拌。(3)检测乳糖的分解：保温到时后，将牛奶过滤。用移液管分别取A烧杯和B烧杯内的牛奶滤液各2 mL，放到两支试管中，用移液管取斐林试剂各2 mL分别放入被检试管中，然后把试管放入装有热水的烧杯中，摇动试管，观察试管中溶液颜色的变化。(4)固定化酶的回收：实验完成后，用缓冲液反复洗涤固定化酶，再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，然后于0
9、4 下保存。3.实验现象两只试管中，砖红色较深的是A，说明固定的乳糖酶能分解乳糖，产生还原糖。4.固定化酶应用的常见方式(1)间歇式：每次反应完后，经离心或过滤法收回的酶可以重复使用。(2)连续式：用固定化酶制成的反应柱进行不间断的重复使用，如图为固定化葡萄糖异构酶的反应柱示意图。图中是反应柱，是固定化酶，是分布着小孔的筛板，不允许酶颗粒通过，而反应液可以自由流出。1.写出乳糖的组成及特点。答案乳糖是一种由半乳糖和葡萄糖通过1,4糖苷键构成的二糖，它的甜度在甜味糖中最小，溶解度也最低。2.利用斐林试剂检测还原糖的原理是什么？答案还原糖与斐林试剂沸水浴会出现砖红色沉淀。3.为什么固定化酶要回收？
10、答案因为固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用。归纳总结检测牛奶中乳糖的分解实验的注意事项(1)检测乳糖酶对牛奶的分解时，为了使实验现象更明显，可以适当减少底物鲜牛奶的量或增加固定化酶的含量，或适当延长保温时间。(2)加酶分解时，温度不宜过高或过低，否则酶变性失活或活性太低，得不到实验结果或不明显。(3)酶回收要用缓冲液反复洗涤固定化酶，维持酶的活性；再用体积分数为0.05%的双氧水洗涤，达到消毒目的，以防固定化酶被微生物污染；然后于04 下保存，以备下次再使用。3.下列关于检测牛奶中乳糖的分解实验的相关叙述，错误的是()A.乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖B.还原糖可与双缩脲试剂反应产生砖
11、红色沉淀C.根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性D.实验步骤：鲜牛奶处理加酶分解检测乳糖的分解固定化酶的回收答案B解析牛奶中乳糖分解的检测原理是乳糖酶可以将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖；还原糖可与斐林试剂反应产生砖红色沉淀；根据化合物颜色的深浅变化，可以了解乳糖酶的作用活性。实验步骤：鲜牛奶处理加酶分解检测乳糖的分解固定化酶的回收。一题多变(1)斐林试剂的组成成分？答案斐林试剂是由质量分数为10%的氢氧化钠溶液和质量分数为5%的硫酸铜溶液配制而成的。(2)斐林试剂的使用特点？答案现配现用、混合使用。1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是()A.固定化细胞技术在多步连续催化反
12、应方面优势明显B.在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C.利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D.利用固定化酵母菌细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物答案A解析A项中，固定化细胞技术由于保留了细胞内原有的多酶系统，多步连续催化反应的优势非常明显；B项中，酶的催化受温度、pH的影响，不受氧浓度的影响；C项中，酶的降解作用不需各种营养条件；D项中，糖类的作用不只是作为反应底物，还能维持酵母菌细胞的渗透压，防止酵母菌细胞过多地吸水或失水。2.下列关于固定化酶技术的说法，正确的是()A.固定化酶技术就是固定反应物，并将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B.固定化酶的优势在
13、于能催化一系列的酶促反应C.固定化酶中的酶无法重复利用D.固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术答案D解析固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可以重复利用，缺点是无法同时催化一系列酶促反应；在固定过程中，固定的是酶而不是反应物，因此A、B、C均错误。3.酶的固定方法不包括()A.将酶吸附在载体表面上B.将酶相互连接起来C.将酶包埋在细微网格里D.将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶答案D解析加酶洗衣粉中的酶没有固定，不可重复利用。4.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是()A.生产过程中不需考虑温度和pHB.为防止杂菌污染
14、，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌C.通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行D.固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱答案C课时作业基础过关1.固定化酶技术通常采用()A.包埋法B.化学结合和物理吸附固定法C.活化法D.微囊化法答案B解析酶的体积较小，容易从包埋的材料中漏出来，所以一般采用化学结合和物理吸附固定法。2.制备固定化乳糖酶时要用缓冲液配制凝胶单体，下列说法错误的是()A.酶活性不受温度的影响B.酶活性易受酸碱度的影响C.缓冲液配制凝胶单体是保持溶液中pH的相对稳定D.缓冲液配制凝胶单体可以保证实验过程中酶的活性答案A解析酶活性易受温度和酸碱度的影响，用缓冲液
15、配制凝胶单体是保持溶液中pH的相对稳定，从而保证实验过程中酶的活性。3.下列有关检测牛奶中乳糖的分解的实验过程正确的是()A.取新鲜牛奶0.5 kg放入1 000 mL干净烧杯中，100 沸水灭菌。将灭菌后的牛奶冷却至45 50 ，过滤后平均分为两部分，一部分放入A烧杯，另一部分放至B烧杯内作对照B.向A烧杯内加入适量的固定化酶制剂，45 50 条件下保温45 min，保温过程中要用普通玻璃棒不停用力搅拌C.保温到时后，将牛奶过滤。用移液管分别取A烧杯和B烧杯内的牛奶滤液各2 mL，放到两支试管中，用移液管取斐林试剂各2 mL，分别放入被检试管中，然后把试管放入装有热水的烧杯中，摇动试管，观察试管中溶液颜色的变化D.实验完成后，用蒸馏水反复洗涤固
