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1、Enzyme 第三章酶 酶的概念 目前将生物催化剂分为两类酶 核酶 脱氧核酶 酶是一类由活细胞产生的 对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质 酶学研究简史 公元前两千多年 我国已有酿酒记载 一百余年前 Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果 1877年 Kuhne首次提出Enzyme一词 1897年 Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液 实现了发酵 1926年 Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶 1982年 Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性 提出核酶 ribozyme 的概念 1995年 JackW Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段 称为脱氧核
2、酶 deoxyribozyme 第一节酶的分子结构与功能TheMolecularStructureandFunctionofEnzyme 酶的不同形式 单体酶 monomericenzyme 仅具有三级结构的酶 寡聚酶 oligomericenzyme 由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶 多酶体系 multienzymesystem 由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物 多功能酶 multifunctionalenzyme 或串联酶 tandemenzyme 一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合 多种不同催化功能存在于一条多肽链中 这类酶称为多功能酶 一 酶的分子组成 各部分在
3、催化反应中的作用 酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质 金属酶 metalloenzyme 金属离子与酶结合紧密 提取过程中不易丢失 金属激活酶 metal activatedenzyme 金属离子为酶的活性所必需 但与酶的结合不甚紧密 金属离子的作用稳定酶的构象 参与催化反应 传递电子 在酶与底物间起桥梁作用 中和阴离子 降低反应中的静电斥力等 小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用 传递电子 质子或其它基团 小分子有机化合物在催化中的作用 辅助因子分类 按其与酶蛋白结合的紧密程度 辅酶 coenzyme 与酶蛋白结合疏松 可用透析或超滤的方法除去 辅基 prosthet
4、icgroup 与酶蛋白结合紧密 不能用透析或超滤的方法除去 二 酶的活性中心 必需基团 essentialgroup 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中 一些与酶活性密切相关的化学基团 目录 或称活性部位 activesite 指必需基团在空间结构上彼此靠近 组成具有特定空间结构的区域 能与底物特异结合并将底物转化为产物 酶的活性中心 activecenter 活性中心内的必需基团 位于活性中心以外 维持酶活性中心应有的空间构象所必需 活性中心外的必需基团 底物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 目录 溶菌酶的活性中心 谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团 色氨酸62和63
5、 天冬氨酸101和色氨酸108是结合基团 A F为底物多糖链的糖基 位于酶的活性中心形成的裂隙中 第二节酶促反应的特点与机理TheCharacteristicandMechanismofEnzyme CatalyzedReaction 酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化 只能催化热力学允许的化学反应 只能加速可逆反应的进程 而不改变反应的平衡点 一 酶促反应具有极高的效率 一 酶促反应的特点 酶的催化效率通常比非催化反应高108 1020倍 比一般催化剂高107 1013倍 酶的催化不需要较高的反应温度 酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能 activationene
6、rgy 酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能 活化能 底物分子从初态转变到活化态所需的能量 一种酶仅作用于一种或一类化合物 或一定的化学键 催化一定的化学反应并生成一定的产物 酶的这种特性称为酶的特异性或专一性 酶的特异性 specificity 二 酶促反应具有高度的特异性 根据酶对其底物结构选择的严格程度不同 酶的特异性可大致分为以下3种类型 绝对特异性 absolutespecificity 只能作用于特定结构的底物 进行一种专一的反应 生成一种特定结构的产物 相对特异性 relativespecificity 作用于一类化合物或一种化学键 立体结构特异性 stereospecific
7、ity 作用于立体异构体中的一种 三 酶促反应的可调节性 对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等 酶促反应受多种因素的调控 以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要 其中包括三方面的调节 二 酶促反应的机理 一 酶 底物复合物的形成与诱导契合假说 诱导契合假说 induced fithypothesis 酶底物复合物 酶与底物相互接近时 其结构相互诱导 相互变形和相互适应 进而相互结合 这一过程称为酶 底物结合的诱导契合假说 目录 酶的诱导契合动画 羧肽酶的诱导契合模式 目录 二 酶促反应的机理 1 邻近效应 proximityeffect 与定向排列 or
8、ientationarrange 2 多元催化 multielementcatalysis 3 表面效应 surfaceeffect 第三节酶促反应动力学KineticsofEnzyme CatalyzedReaction 概念研究各种因素对酶促反应速度的影响 并加以定量的阐述 影响因素包括有酶浓度 底物浓度 pH 温度 抑制剂 激活剂等 研究一种因素的影响时 其余各因素均恒定 一 底物浓度对反应速度的影响 单底物 单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下 用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度 即底物的消耗量很小 一般在5 以内 时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度
9、 研究前提 在其他因素不变的情况下 底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比 反应为一级反应 目录 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速 反应为混合级反应 目录 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加 达最大速度 反应为零级反应 目录 一 米 曼氏方程式 中间产物 酶促反应模式 中间产物学说 1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式 即米 曼氏方程式 简称米氏方程式 Michaelisequation S 底物浓度V 不同 S 时的反应速度Vmax 最大反应速度 maximumvelocity m 米
10、氏常数 Michaelisconstant 米 曼氏方程式推导基于两个假设 E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应 而ES分解为E及P的反应为慢反应 反应速度取决于慢反应即V k3 ES 1 S的总浓度远远大于E的总浓度 因此在反应的初始阶段 S的浓度可认为不变即 S St 推导过程 稳态 是指ES的生成速度与分解速度相等 即 ES 恒定 K1 Et ES S K2 ES K3 ES 则 2 变为 Et ES S Km ES 当底物浓度很高 将酶的活性中心全部饱和时 即 Et ES 反应达最大速度Vmax K3 ES K3 Et 5 将 5 代入 4 得米氏方程式 当反应速度为最大反应速度一
11、半时 Km值的推导 Km S Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度 单位是mol L 二 Km与Vmax的意义 Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度 意义 a Km是酶的特征性常数之一 b Km可近似表示酶对底物的亲和力 c 同一酶对于不同底物有不同的Km值 Vmax定义 Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度 与酶浓度成正比 意义 Vmax K3 E 如果酶的总浓度已知 可从Vmax计算酶的转换数 turnovernumber 即动力学常数K3 定义 当酶被底物充分饱和时 单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数 意义 可用来比较每单位酶的催化能力 酶
12、的转换数 三 m值与 max值的测定 1 双倒数作图法 doublereciprocalplot 又称为林 贝氏 Lineweaver Burk 作图法 2 Hanes作图法 在林 贝氏方程基础上 两边同乘 S S V Km Vmax S Vmax 二 酶浓度对反应速度的影响 当 S E 酶可被底物饱和的情况下 反应速度与酶浓度成正比 关系式为 V K3 E 双重影响温度升高 酶促反应速度升高 由于酶的本质是蛋白质 温度升高 可引起酶的变性 从而反应速度降低 三 温度对反应速度的影响 最适温度 optimumtemperature 酶促反应速度最快时的环境温度 低温的应用 四 pH对反应速度的
13、影响 最适pH optimumpH 酶催化活性最大时的环境pH 五 抑制剂对反应速度的影响 酶的抑制剂 inhibitor 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂 区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性 抑制作用的类型 不可逆性抑制 irreversibleinhibition 可逆性抑制 reversibleinhibition 竞争性抑制 competitiveinhibition 非竞争性抑制 non competitiveinhibition 反竞争性抑制 uncompetitiveinhibition 一 不可逆性抑制作用 概念抑制剂
14、通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合 使酶失活 举例有机磷化合物 羟基酶解毒 解磷定 PAM 重金属离子及砷化合物 巯基酶解毒 二巯基丙醇 BAL 有机磷化合物 路易士气 失活的酶 羟基酶 失活的酶 酸 巯基酶 失活的酶 酸 BAL 巯基酶 BAL与砷剂结合物 二 可逆性抑制作用 概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶 底物复合物可逆性结合 使酶的活性降低或丧失 抑制剂可用透析 超滤等方法除去 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 类型 竞争性抑制作用 反应模式 定义抑制剂与底物的结构相似 能与底物竞争酶的活性中心 从而阻碍酶底物复合物的形成 使酶的活性降低 这种抑制作用称为竞争性抑制作用 特点
15、抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度 I与S结构类似 竞争酶的活性中心 动力学特点 Vmax不变 表观Km增大 举例 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 2 非竞争性抑制 反应模式 特点 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合 底物与抑制剂之间无竞争关系 抑制程度取决于抑制剂的浓度 动力学特点 Vmax降低 表观Km不变 反竞争性抑制 反应模式 特点 抑制剂只与酶 底物复合物结合 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度 动力学特点 Vmax降低 表观Km降低 各种可逆性抑制作用的比较 六 激活剂对反应速度的影响 激活剂 activator
16、 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 必需激活剂 essentialactivator 非必需激活剂 non essentialactivator 七 酶活性测定和酶活性单位 酶的活性是指酶催化化学反应的能力 其衡量的标准是酶促反应速度 酶促反应速度可在适宜的反应条件下 用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示 酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度 它反映在规定条件下 酶促反应在单位时间 s min或h 内生成一定量 mg g mol等 的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量 国际单位 IU 在特定的条件下 每分钟催化1 mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位 催量单位 katal 催量 kat 是指在特定条件下 每秒钟使 mol底物转化为产物所需的酶量 kat与IU的换算 1IU 16 67 10 9kat 第四节酶的调节TheRegulationofEnzyme 调节对象关键酶 一 酶活性的调节 一 酶原与酶原的激活 酶原 zymogen 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体 此前体物质称为酶原 酶原的激活在一定条件下 酶原向有活性酶转化的过程 酶原激活的机理
