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1、资源微生物技术第三章 微生物技术基本试验1第三章 微生物技术基本试验一、培养基的配制二、灭菌方法三、接种方法四、细菌总数目的显微镜计数方法五、细菌的生长曲线六、菌体的红外光谱测定样品制备方法七、菌体的扫描电镜样品制备方法八 菌体表面 Zeta 电位的测试方法2一、固体培养基的配制固体培养基灭菌后摆斜面3放入灭菌锅前的液体培养基一、固体培养基的配制4二、灭菌方法高压蒸汽灭菌法： 1、用途 （1）无菌水的制备 （2）玻璃器皿的灭菌 （滴管、移液管、锥形瓶、烧杯） （3）培养基的灭菌2、 121.5下灭菌 2030 分钟。5试管或锥形瓶口的密封方法不正确的棉塞试管帽正确的棉塞6棉塞的叠法棉塞的叠法7
2、蒸汽高压灭菌锅电加热圈水位线压力表安全阀放气阀8灭 菌 器9灭 菌 器10高压蒸汽灭菌步骤开始加热时， 打开放气阀；加热至放气阀冒出蒸汽；5 分钟后，关上放气阀；开始计时，灭菌 30 分钟；关上电源开关，自然冷却；至压力表指针为零，打开放气阀；打开锅盖 6 个密封旋钮。11步骤：1、接种前将无菌操作台、接种环、培养基紫外线灭菌 30 分钟（摆好了斜面的试管装固体培养基、表面皿装的固体培养基、锥形瓶装的液体培养基）三、接种方法接种环12无菌操作台132、点燃酒精灯；3、将接种环的钨丝在酒精灯火焰上加热变红（灭菌） ，4、用接种环在菌种保存试管中轻轻刮少许细菌，5、快速将带有细菌的接种环浸入液体培
3、养基中；或在固体培养基中画“之”字形或“井”字形。见下图三、接种方法1415四、细菌总数目的显微镜计数方法特制的载玻片正面图特制的载玻片侧面图步骤：1、 将细菌悬液用蒸馏水稀释 A 倍；2、 将配好的细菌稀释液滴入在玻片上；3、 盖好盖玻片。16四、细菌总数目的显微镜计数方法N1=(n1+n2+n3+n4)/4N2N3N4N5载玻片上刻有的大方格的尺寸：边长 1.0 mm, 盖上盖玻片，则其间高度为 0.1 mm。因此，每个大方格的体积为 0.1 立方毫米。17四、细菌总数目的显微镜计数方法n118四、细菌总数目的显微镜计数方法n219四、细菌总数目的显微镜计数方法n320四、细菌总数目的显微
4、镜计数方法n421四、细菌总数目的显微镜计数方法计算步骤 1、 n （n1 + n2 + n3 + n4 ）42、 N1 16n3、 N （N1 N2 N3 N4 N5）54、 一个大方格（0.1 立方毫米）中细菌的总数 N255、 1 mL 1 立方厘米 1000 立方毫米； 细菌液稀释了 A 倍。6、 1 mL 溶液中总的细菌数为( 个) 100025NA0.122五、细菌的生长曲线在 HZQ-C 空气浴震荡器中、在 28C、160 r/min 的震荡频率下培养细菌；每隔 24 h 取出 100 mL 菌悬浮液，采用转速为 16000 r/min TGL16 台式高速离心机离心分离 10
5、min 后测细菌的湿重。然后绘制细菌生长时间（h）与细菌生长量（每 100 mL 菌液中菌体湿重量）曲线。 23空气浴震荡器2425草分枝杆菌的生长曲线26六、菌体的红外光谱测定样品制备方法操作步骤：1、离心分离菌体；2、用蒸馏水洗涤；3、在 50 C 的恒温烘箱中干燥；4、取干燥的菌体与光谱纯溴化钾一起在玛瑙研体中研磨；5、将适量的粉末放入压片机中，进行压片；6、用红外光谱仪（510P FT IR 型）对样品进行分析测定。27红外光谱的基本概念* 红外光谱是一种吸收光谱。在 4000400 cm1 的红外线照射下，有机物分子选择性地吸收其中某些频率后，用红外光谱仪记录所形成的吸收谱带，就称为
6、红外光谱。* 红外光谱的横坐标是波数（cm1）或频率；纵坐标是光线的透过率（T ） ，或摩尔吸收系数来表示：1/ （CL） * lg（I0/I） C浓度 L比色池厚度 I透过光的强度 I0入射光的强度28为什么不同有机基团会产生不同的红外光谱？ -OH、-SH、-NH 等化学键存在振动。 振动形式有：伸缩振动、弯曲振动。弯曲振动包括：面内弯曲（剪式振动 、平面摇摆振动）面外弯曲（ 非平面摇摆振动、扭曲振动）伸缩振动包括： 对称伸缩振动、不对称伸缩振动 29 化学键振动存在振动频率、存在振动能级。没有外界干扰时，分子处于最低的振动能级。 当红外光线照射到有机基团的化学键上时，分子发生振动能级跃迁
7、，跃迁需要吸收一定的能量，该能量通常由照射的红外光线来供给。 化学键的键能、键长、键角、种类如单键、双键、叁键、共价键、离子键等是决定吸收多少能量的内在因素，也就是决定红外光谱的峰位、形状、峰强的内在因素。反过来说，红外光谱可以提供分子内部键参数的信息。红外光谱基本原理30红外光谱基本原理 红外光谱所提供的能量与有机基团结构的振动能级差相吻合； 紫外光线、可见光线提供的能量则不与有机基团结构的振动能级相匹配； 红外光线提供的能量不与无机物的分子结构振动能级相匹配！ 31红外光谱识谱法1、三个重要特征* 谱带位置：基团的最有用的特征，给出基团的信息* 谱带形状：给出基团信息* 谱带的相对强度：给
8、出两个信息， 一是定量的概念；二是指示某特殊基团或元素存在324000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 苦味诺卡氏菌的红外光谱Wavenumber cm-1Transmittance %33Transmittance %4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumbers cm-1吸附了 Pb2的诺卡氏菌红外光谱图吸附了 Zn2的诺卡氏菌红外光谱图诺卡氏菌的红外光谱34* 吸收谱带区：分子中各键的振动频率常常受到整个分子的影响，但是有些键如羰基、OH、NH 等因吸收峰位于高频区，故受分子中其他结构的影响较小，高频
9、区 40001333 cm1 的吸收峰比较稀疏，易于辨认，通常也叫特征谱带区、该区能用来鉴定官能团存在的吸收峰称作特征吸收峰。* 指纹区：低频区 1333667 cm-1，这一区域谱带特别密集，犹如人的指纹，各种化合物在结构上微小差别在指纹区都会得到反映，因此，对鉴别有机化合物很有用处。* 相关峰：一个基团常有数种振动形式，每种红外活性的振动通常都相应地产生一个吸收峰，习惯上把这些相互依存而又相互佐证的吸收峰叫做相关峰红外光谱识谱法 （三个区）35七、菌体的扫描电镜样品制备方法 微生物样品在用于扫描电镜观察之前，需经过清洗、固定、脱水等步骤。固定是指用化学固定剂迅速杀死细胞的过程。固定的目的是
10、尽可能使细胞中的各种物质保持生活状态的结构，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上。经过良好固定的细胞物质，不会由于后序的脱水处理而发生移位或丢失。36扫描电镜样品制备方法扫描电镜生物样品的制备步骤如下：(1) 1戊二醛溶液的配制：取 50 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲溶液于 100 mL 容量瓶中，加入 4 mL 25戊二醛（市售的常见浓度）水溶液，加蒸馏水至满刻度。(2) 把离心分离后的细菌放入 10 mL 配制的 1戊二醛溶液中固定 2030 min，固定时采用搅拌，使材料均匀地分布在固定液中。37(3) 离心分离（ 16000 r/min） ，使固定液与细菌分开，弃去上清液。(4)
11、 用磷酸盐缓冲溶液（ 0.1mol/L， pH 7.2）漂洗并重新离心，弃去上清液，反复离心几次。(5) 用逐级上升浓度的乙醇，从 30%5070 %80 %90 %无水乙醇（ 34 次） ，脱水，每级10 min，过急的脱水会引起细胞的收缩变形。扫描电镜样品制备方法38(6) 用滴管将含有细菌的乙醇液滴在洁净抛光的铝片（10 mm10 mm2 mm）上，干燥、喷金。(7)、在 SSX-550 型扫描电镜上观察细菌细胞的显微图像。扫描电镜样品制备方法39微生物的扫描电镜图片吸附前的诺卡氏菌 吸附后的诺卡氏菌40步骤:1、将细菌离心分离；用电解质溶液配成细菌悬浮液。2、用针头将细菌悬浮液抽到电泳
12、槽小室中。3、在电泳仪上测出细菌微粒的电泳淌度 电泳淌度单位时间、单位电压降下的微粒移动的距离（cm2/s.V ）八 菌体表面 Zeta 电位的测试方法小室41用 WD-9408D 型微电泳仪，在离子强度为 0.001mol/L 的 NaCl 溶液中，测定菌体微粒的电泳淌度。根据公式计算出 电位。= (ku0/D)91012 （mV） 其中， k 为颗粒形状系数。当颗粒为球形时 k 取 6；当颗粒为杆形时 k 取 4； 为溶液的粘度（Pas ）D 为溶液的介电常数（无量纲）u0 为微粒的电泳淌度（m2/s V） 。八 菌体表面 Zeta 电位的测试方法42不同 pH 值下细菌微粒的表面 电位 potential of microorganism particles at different pH value43
