《Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测(1)（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Id1 启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检 测(1)作者：丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰【摘要】目的：扩增 Id1 启动子基因，构建 Id1 启动子 的报告基因载体 . 方法：通过 PCR 及双酶切方法，从 HepG2 细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度 碱基的两段 Id1 启动子序列；分别克隆到报告基因 pGL3 enhancer 载体上，构建包含两段不同长度 Id1 启动子的报告 基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝 癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必
2、纠动子活性 . 结果：经 PCR 方法扩增出大小分别为 1096bp 和 266bp 的两段不同长度的 Id1 启动子片段，序列测定其编码 序列及读框正确， 酶切鉴定亚克隆序列正确 . 瞬时转染 HepG2 后经报告基因检测，两段启动子均具有转录活性 . 结论：成 功构建了 Id1 启动子的报告基因载体，为进一步研究 Id1 启 动子和肝癌的关系奠定了实验基础 .该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠【关键词】分化抑制因子0 引言Id 蛋 白 即 分 化 抑 制 或 DNA 结 合 抑 制 蛋 白 ( InhibitorofDifferentiationand/orDNAbinding
3、protein s)是缺少DNA吉合结构域的螺旋环 螺旋(helix loop该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠helix , HLH蛋白，是HLH转录因子的显性负性调节分子.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠已知哺乳动物Id蛋白家族有Id1Id4等4位成员.它们可 调节多种细胞进程，包括细胞生长、衰老、分化、凋亡和血 管生成等 1. 研究 2表明 Id 蛋白特别是 Id1 ，可通过 灭活肿瘤抑制因子和激活生长促进通路而促进哺乳动物细 胞的增殖和细胞周期的进行，其可能是肿瘤增殖所必需的关 键因子 .Id1 可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风 险的有用指标，并且可作
4、为治疗肝癌的靶向分子 . 我们拟构 建两段包含不同长度 Id1 启动子片段的报告基因载体，转染 HepG2细胞后检测两段Id1启动子的活性.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠1 材料和方法材料 pGL3 enhancer 载体，内参照 pRL TK 载体和 Dual luciferasereporterKit （ Promega 公 司 ）； LipofectaminTMReagent 和 T4DNA连接酶（Invitrogen 公司）； 细胞基因组DNA提取试剂盒（U gene公司）；高保真TaqDNA 聚合酶（上海生物工程公司）； PlasmidMiniprepKit和该文档为
5、文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠GelExtrationKit（ Omega 公 司 ）；该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠DNAmarker:GeneRulerTM100bpDNAladderPlus和该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠GeneRulerTM1KbDNAladder（MBI 公司）；胰蛋白胨及酵母提 取物（宝泰克公司）；限制性内切酶 Hind川，Kpnl （大连宝 生物工程公司） ；其余试剂均为国产分析纯 .TD20/20 荧光照 度计（TurnerBioSystems 公司）；HepG2细胞和 JM109 菌株该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所
6、有，违责必纠均为本实验室保存方法启动子报告基因载体的构建引物设计自 http:/ 网站数据库检索获得 Id1 ( GenBank该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠/EMBL提取号码：NM 002165)启动子序列的-3000100该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5 端加入 Kpn I的酶切位点GGTAC,在下游引物 5 端加入该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠Hind川的酶切位点AAGCTT从转录起始零点开始，两段启动 子片段长度分别为：1019+ 76( 1096bp)和189+ 76. 上游引物分别为
7、Fw1： gggtaccgggagcacgggaactagc 和 Fw2： gggtaccccacccttgctgttctga； 下 游 引 物 Rv ：该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠aagcttggagaatgggcaaagcgaaa.细胞培养及模板提取将 HepG2细胞用含100mL/L胎牛血 清的RPMI1640培养基在37C, 50mL/LCO2的孵箱中培养.收 集对数生长期细胞约 1 X 107 ,以细胞基因组 DNA提取试剂盒 提取基因组 DNA.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠启动子基因的克隆以 HepG2细胞基因组DNA为模板，用 Fw1为上游引物
8、、Rv为下游引物，经预实验选择 94C变性 1min , 55C退火1min , 72C延伸1min,共30个循环，获得 一长度为1096bp的片段，命名为Id1p1 ;选用Fw2为上游引 物、Rv为下游引物，经预实验选择 94C变性30s , 54C退火 30s, 72C延伸45s,共30个循环，获得一长度为266bp的片 段，命名为 Id1p2. 用 10g/L 琼脂糖凝胶进行电泳获得 2 条鉴 定条带，大小分别约为 1100bp 和 260bp. 参照试剂盒的操作 说明回收并纯化 .该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠启动子载体的构建与测序将荧光素酶报告基因 pGL3 enha
9、ncer载体分别行 Kpn I和Hind川双酶切，回收.同时将 之前回收的PCR产物同样经KpnI和Hind川双酶切及琼脂糖 凝胶电泳，分别回收约1100bp和260bp条带.使之分别在T4 连接酶的作下与 pGL3 enhancer载体以3 : 1和10 : 1的 浓度比于16 C连接12h，使Id1p1和Id1p2基因序列插入无 启动子的 pGL3 enhancer 载体中 . 以低温 CaCl2 法转化感 受态细菌，涂布于含氨苄青霉素（100mg/L）的固体LB培养 皿上， 12h 后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取 质粒.行Kpn I和Hind川双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组
10、质粒. 最终构建成重组报告基因 载体 Id1p1/PGL3 和 Id1p2/PGL3.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠启动子载体转染肝癌 HepG2细胞系将两种重组质粒、空 载体pGL3 enhancer和内参照pRLTK载体转化的阳性该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠菌株，在LB培养基中37C摇床培养过夜，按质粒提取说明 分别提取 Id1p1/pGL3 ，Id1p2/pGL3 、空载体 pGL3 enhancer 和pRL TK的DNA经紫外分光光度仪测定 A260nm值.按照 LipofectaminTMReagent 脂质体转染系统说明，于转染前 1 日将细胞接
11、种于 24空板，5X 104/孑L,第2日当细胞约90%该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠融合时，每孔分别定量加入ld1p1/pGL3卩g, PRL TK内参该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠照载体100ng, LipofectaminTM5卩L和无血清培养基 200卩 L.6h 后换含 FBS100mL/L的 RPMI164Q 培养 18h.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠报告基因活性的检测瞬时转染 24h 后收集、裂解细胞， 离心取上清，用 Dual LuciferaseReporterAssaySystem 在 TD20/20 荧光照度计上测定裂解上
12、清内 Luc 活性, 计算 FireflyLuc/RenillaLuc 的 比 值 ， 并 以 空 载 体 pGL3 enhancer 转染细胞作对照，进行比较以判断 Id1p1 和 Id1p2 启动子活性 .该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠2 结果目的基因的克隆及测序以肝癌细胞 HepG2基因组DNA为 模板， 分别克隆出两段 Id1 启动子， 分别为 1096bp 的 Id1p1 和 266bp 的 Id1p2 （图 1）.该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳略启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经Kpn I和Hind川双酶切得到的Id1p1和Id1p2两重组质粒和 pGL3 enhancer 载体的相应条带，经 T4 连接酶连接后转化感受态 细菌.再经Kpn I和Hind川酶切后，两种重组质粒分别释放 出 1096bp 和 266bp 大小的片段（图 2） . 测序结果亦证实两 段均包含 Id1 启动子序列 . 表明包含不同长短的 Id1 启动子 报告基因载体构建成功 .该文档为文档投稿赚钱网作品，版权所有，违责必纠（作者：3COME未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service 立即删除）
