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1、核酸的提取及鉴定 核酸是遗传信息的载体 是最重要的生物信息分子 是分子生物学研究的主要对象 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要 最基本的操作 一 核酸的分类 DNA 脱氧核糖核酸 主要存在于细胞核的染色体中 核外也有少量DNA 如线粒体DNA mtDNA 叶绿体DNA cpDNA 质粒DNA RNA 核糖核酸 存在于细胞质中 如mRNA rRNA tRNA等 除上述DNA RNA外 还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体 其或只含DNA 或只含有RNA 二 DNA提取的几种方法 一 非基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法煮沸法 线粒体 叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法
2、质粒DNA 碱裂解法 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多 且染色体DNA为线状分子 而质粒DNA为共价闭合环状分子 当用碱处理DNA溶液时 线状染色体DNA容易发生变性 共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中 从而可通过离心将两者分开 质粒DNA 碱裂解法 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 质粒DNA 煮沸法 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多
3、 且染色体DNA为线状分子 而质粒DNA为共价闭合环状分子 当加热处理DNA溶液时 线状染色体DNA容易发生变性 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中 从而可通过离心将两者分开 细胞器DNA 差速离心法 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法 将待分离物质置于均匀介质 蔗糖 中 以一定的转速进行离心 比重大的物质优先沉降 比重小的却处于上层 从而得以分离 线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器 自身可编码蛋白 它们的比重和大小一定 因而在同一离心场内的沉降速度也
4、一定 根据这一原理 常用不同转速的离心法 将细胞内各种组分分级分离出来 二 基因组DNA的提取 CTAB法 CTAB法原理 CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可溶解细胞膜 并与核酸形成复合物 该复合物在高盐溶液中 0 7mol LNaCl 是可溶的 通过有机溶剂抽提 去除蛋白 多糖 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来 注 CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出 因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热 且离心时温度不要低于15 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris HCl pH8 0 提供一个缓冲
5、环境 防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子 抑制DNase活性 NaCl提供一个高盐环境 使DNP充分溶解 存在于液相中 CTAB溶解细胞膜 并结合核酸 使核酸便于分离 巯基乙醇是抗氧化剂 有效地防止酚氧化成醌 避免褐变 使酚容易去除 二 基因组DNA的提取 CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的络合物 能与多酚形成一种不溶的络合物质 有效去除多酚 减少DNA中酚的污染 同时它也能和多糖结合 有效去除多糖 二 基因组DNA的提取 CTAB法 CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DN
6、A溶液 二 基因组DNA提取 CTAB法 SDS法原理 二 基因组DNA的提取 SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂 在高温 55 65 条件下能裂解细胞 使染色体离析 蛋白变性 释放出核酸 提高盐 KAc或NH4Ac 浓度并降低温度 冰浴 使蛋白质及多糖杂质沉淀 离心后除去沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA SDS法DNA提取缓冲液 SDS法流程图 以动物组织为例 二 基因组DNA的提取 SDS法 三 基因组DNA 其它方法 物理方式 玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法化学方式 异硫氰酸胍法 碱裂解法生物方式 酶法 根据细胞裂解方式的不同有 三 基因组DN
7、A 其它方法 吸附材料结合法 根据核酸分离纯化方式的不同有 硅质材料阴离子交换树脂磁珠 高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱 快捷高效 低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物 从而达到分离目的 三 基因组DNA 其它方法 浓盐法 有机溶剂抽提法 密度梯度离心法 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同 将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂 同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 四 动物基因组DNA的提取 主要方法 1 浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同 将二者分离 1 用1M氯化钠提取 得
8、到的DNP粘液2 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡 使乳化3 离心除去蛋白质 此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间 而DNA位于上层水相中4 用2倍体积95 乙醇可将DNA钠盐沉淀出来 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性 可以直接从生物材料中提取DNA 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合 而阴离子去污剂能够破坏这种价键 所以常用阴离子去污剂提取DNA 2 阴离子去污剂法 3 苯酚抽提法 苯酚作为蛋白变性剂 同时抑制了DNase的降解作用 用苯酚处理匀浆液时 由于蛋白与DNA连接键已断 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶 蛋白分子溶于酚相 而DNA溶于水相 离心分
9、层后取出水层 多次重复操作 再合并含DNA的水相 利用核酸不溶于醇的性质 用乙醇沉淀DNA 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 1 材料 设备及试剂 材料 冷冻或新鲜抗凝全血 组织样品设备 EP管 微量取液器 20 l 200 l 1000 l 台式高速离心机 涡旋振荡器试剂 裂解液ligsisbuffer 40mMTris 醋酸 20mM醋酸钠 1mMEDTA 1 SDS pH8 0 Tris 饱和酚 氯仿 异戊醇 NaAc RNA酶 无水乙醇 灭菌水 1 在500 l抗凝血中加入ligsisbuffer1000 l 充分颠混至清亮 以4000rpm 离心5min 弃上清液 2 沉淀中加
10、入ligsisbuffer1500 l 充分匀浆 以6000rpm 离心5min 3 彻底弃去上清 加入extractionbuffer500 l 裂解细胞 混匀置于37 水溶1h 4 加入8 l的蛋白酶K 颠混 37 过夜 或55 3h 但是37 效果要好些 5 每管加入450 l饱和酚 取溶液下层 缓慢摇晃10min 以5500rpm 离心15min 2 操作步骤 血样 6 取上清 每管加入250 l饱和酚和250 l氯仿 异戊醇 24 1 摇匀10min 以5500rpm 离心15min 7 取上清 每管加入500 l氯仿 异戊醇 摇匀10min 以5500rpm 离心15min 8 取
11、上清 每管加50 l的3M的NaAC 适量无水乙醇 预冷 至满 摇匀放入 20 保存2h以上 9 以12000rpm 离心20min 去上清 加入70 乙醇500 l 以12000rpm 离心5min 去上清 50 60 干燥 10 加入50 l灭菌去离子水 转弹 混匀 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合 以复合物形式存在 三 核酸制备的一般原则 微溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 DNA溶液粘度很大 RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下 可以从溶液中沉降下来 分离纯化核酸总的原则 核酸纯化应达到的要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作
12、用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 其它生物大分子的污染应降低到最低程度 排除其它核酸分子的污染 应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子 蛋白 脂类 多糖类 的污染 核酸制备时应注意的事项 尽量简化操作步骤 缩短提取过程 减少化学因素对核酸的降解 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解 排除核酸酶 降低温度 改变pH及盐的浓度 都利于对核酸酶活性的抑制 但均不如利用核酸酶抑制剂更有利 当然 几个条件并用更好 对于DNA 抑制DNase活力很容易 但防止机械张力拉断则更重要 对于RNA 因分子较小 不易被机械张力拉断 但抑制RNase活力较难 故在RNA提取中设法抑制RN
13、ase更重要 核酸酶的抑制和抑制剂 加入少量金属离子螯合剂 如0 01mol LEDTA或柠檬酸钠 DNase基本可以全部失活 去垢剂 蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活 DNase抑制 操作要带手套 所有器皿要严格消毒 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂 RNase抑制 常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯 DEPC 抑制强烈 不彻底异硫氰酸胍有效抑制 分解核蛋白氧钒核糖核苷复合物有效抑制RNA酶的蛋白抑制剂 RNasin 有效抑制其它 SDS 尿素 硅藻土等有效抑制 上述大部分试剂有致癌之嫌 应谨慎操作 核酸本身带负电荷 结合带正电荷的蛋白质 用于核酸
14、提取的去垢剂 一般都是阴离子去垢剂 去垢剂的作用 1 溶解膜蛋白及脂肪 使细胞膜破裂 2 溶解核糖体上面的蛋白质 使其解聚 将核酸释放出来 3 对RNase DNase有一定的抑制作用 如 SDS 脱氧胆酸钠 4 氨基水杨酸钠 萘 1 5 二磺酸钠 三异丙基萘磺酸钠 核酸制备中常用的去垢剂 作用 1 使蛋白质变性 沉淀 从核酸提取液中分离除去 以防造成蛋白污染 2 使蛋白质变性 故可使核糖体解聚释放出核酸 3 某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用 如 苯酚 氯仿 盐酸胍 DEPC 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 DNase 降解DNARNase 降解RNA蛋白酶K 降解蛋白质溶
15、菌酶 破碎细胞 核酸制备中常用的酶 四 核酸制备的一般步骤 破碎组织细胞 提取 纯化 I 材料准备II 破碎细胞或包膜 内容物释放III 核酸分离 纯化IV 沉淀或吸附核酸 并去除杂质V 核酸溶解在适量缓冲液或水中 1 材料准备 最好使用新鲜材料 低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时 要选择有核细胞 白细胞 组培细胞培养时间不能过长 否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少 提取前先富集 基因组DNA的提取 质粒DNA的提取 使用处于对数期的新鲜菌体 老化菌体导致开环质粒增加 培养时应加入筛选压力 否则菌体易污染 质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒 如为低拷贝或大质粒 则
16、应加大菌体用量菌株不要频繁转接 质粒丢失 微生物 溶菌酶 SDS裂解 高等植物 捣碎器破碎 液氮研磨 酶法 蛋白酶 如胰蛋白酶 冰冻法 反复冻融或液氮冻后组织捣碎 动物 液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎 细胞器DNA 首先纯化细胞器 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂 2 破碎细胞 防止核酸酶的作用 首先使脱氧核糖核蛋白 核糖体 病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去 3 破碎抽提核酸除去杂质 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染 并除去提取过程中的系列试剂 盐 有机溶剂等 杂质 最后得到均一的核酸样品 4 核酸的纯化 核酸保存的主要条件是温度和介质温度 4 样品经常使用 70 是长期保存的良好温度 为一次性保存 20 保存 避免反复冻融保存介质 灭菌水TE缓冲溶液 最常用 10mmol LTris ClpH8 01mmol LEDTApH8 0 5 核酸样品的保存 6 注意事项 材料准备 最好使用新鲜材料 低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时 要选择有核细胞 白细胞 细胞培养时间不能过长 否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少 提
