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1、渔业水体中五氯苯酚的测定液相色谱-串联质谱法湖南省地方标准征求意见稿编制说明湖南省水产科学研究所2020年6月目录1概述11.1 背景及意义11.2 国内外研究概况41.3 研制的基本思路62现有条件63 标准制定的依据及思路73.1 样品的采集及标准溶液的配制与储存73.2 水样预处理条件的确定73.3 固相萃取条件的优化83.3.1 固相萃取柱的选择93.3.2 洗脱剂的选择103.3.3 洗脱剂的用量103.4 色谱质谱条件的优化113.4.1色谱条件113.4.2质谱条件134 方法的效能指标144.1 方法的定量限144.2 方法的线性范围154.3 方法的准确度、精密度与适用范围1
2、64.4 与HJ 591-2010水质 五氯酚的测定 气相色谱法的比较205 结论206 与有关法律、法规和强制性标准的关系217 作为推荐性标准的建议218 标准在编制过程中意见分歧情况21湖南省地方标准 渔业水体中五氯苯酚的测定 液相色谱-串联质谱法湖南省地方标准征求意见稿编制说明根据湖南省市场监督管理局关于公布2019年度第1批地方标准制修订项目计划的通知（湘市监办字201959号），湖南省水产科学研究所承担“渔业水体中五氯苯酚的测定方法研究”的湖南省地方标准制定工作。本标准制定过程中的全部试验工作现已完成，标准起草小组起草了征求意见稿，现对渔业水体中五氯苯酚的测定液相色谱-串联质谱法征
3、求意见稿的编制工作做如下说明：1概述1.1 背景及意义五氯苯酚(pentachlorophenol,PCP),简称五氯酚，分子式C6Cl5OH,结构式如图1所示，分子量266.32,熔点191,沸点310/分解,相对密度(水=1)1.98,薄片或结晶状,有臭味,难溶于水,易溶于甲醇、丙酮、乙醚等大多数有机溶剂。五氯苯酚的pKa=4.71,在中性和碱性溶液中可解离成离子形态,而在酸性溶剂中主要以分子形态存在。图 1 五氯苯酚的结构式Fig. 1 Chemical structures of PCP.五氯苯酚是一种毒性较强的氯代酚类物质,因其具有高效、杀虫谱广、成本低、使用方便等特点，自20世纪3
4、0年代以来作为杀虫剂、除草剂、木材防腐剂在全球范围内广泛使用1。我国从20世纪50年代开始广泛将五氯苯酚运用于于农业及日常生活各个方面。由于其钠盐易溶于水，使用方便，60年代初曾在长江中下游的血吸虫疫区大量使用，用以杀灭寄生血吸虫的中间宿主钉螺及其它软体动物2。五氯苯酚化学性质稳定,其残留物在环境中降解缓慢，容易在动植物体内富集,造成环境污染和生物蓄积。五氯苯酚对人和哺乳动物毒性大，经呼吸系统吸入或经皮肤吸收会引起内分泌紊乱、呼吸困难、肝肾损坏、不孕等病症，高剂量时可产生胚胎毒性，其存在短期明显的毒性和长期潜在的毒性作用3,4。五氯苯酚对水生生物具有明显的生物毒性，尤其是鱼类和贝类，环境中较低
5、浓度的五氯苯酚易在动植物体内富集，具有极大的潜在危害。鉴于五氯苯酚对生物的毒性和对环境的危害性，许多机构和国家将其列为禁用或限用的污染物。五氯苯酚在1991年被美国联邦列为31种最危险物质之一；国际癌症研究机构（InternationalResearch Agency for Cancer，IRAC）将五氯酚归类为2B 类致癌物；美国环境保护署（Environmental Protection Agency，EPA）将它列为优先控制的环境有机污染物、持久性有机污染物(persistent organic Pollutants，POPs)，限制其只用于木制品的防腐。欧盟于1992年起限制使用，2
6、0 世纪70-90 年代奥地利、印度、印尼、新西兰、瑞典、瑞士等国也相继将其列入禁用范围。中国农业部于2002发布了农业部第193号公告食品动物禁用的兽药及其化合物清单和 NY 5071-2002无公害食品 渔用药物使用准则，明确要求动物食品生产加工中禁用五氯苯酚。五氯苯酚曾作为常用的杀灭血吸虫中间宿主-钉螺的药物，在长江中下游长时间施用。一方面，由于其性质稳定，不易降解，不可避免的在养殖环境中产生残留，前期施用的五氯苯酚对渔业环境造成的影响还会持续相当长的一段时间。水体和底泥中残留的 五氯苯酚 及其钠盐会富集到水生生物体内。另一方面，虽然我国已明确将 五氯苯酚 列入禁用药物的范围，但但张彤晴
7、等5调查报告显示，在渔业生产中仍有部分渔民仍使用 五氯苯酚 杀灭杂鱼进行清塘，导致五氯苯酚在养殖对象体内富集，对渔业产品的安全性存在一定的威胁。国内外对渔业环境中五氯苯酚的浓度和含量的研究报道6-8显示，五氯苯酚 的含量为各种氯代酚之首，且远远高于其它氯代酚浓度，对人类以及动植物存在一定的危害。因此，评估渔业水体中的五氯苯酚残留状况，建立相应的分析方法和标准，对于监测渔业水体中五氯苯酚的含量以及水产品中五氯苯酚污染来源的排查具有积极的意义。国内外已报道的五氯苯酚的检测方法有分光光度法、免疫法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法。我国国家标准渔业水质标准（GB 116
8、07-89）对五氯酚钠在渔业水体中的最高限量值为0.01 mg/L，推荐的测定方法为气相色谱法（HJ 591-2010 ）。该方法样品前处理过程需要进行多次液液萃取和衍生化反应，操作过程繁琐耗时，灵敏度和精密度有待提高。目前国家和农业部尚未颁布检测渔业水体中五氯苯酚的液质标准方法，我省也没有相关的地方标准，因此建立一种简便、快速、灵敏的检测渔业水体中五氯苯酚的测定方法显得尤为重要，不仅可以为渔业主管部门提供更有效的水质监测手段，同时也可完善我国渔业水质标准检测方法。1.2 国内外研究概况液相色谱-串联质谱以其分离速度快、灵敏度高、抗干扰能力好等特点，成为农残分析的新技术，适合环境介质中农药残留
9、的快速筛查和测定9。Sarrin等10采用固相微萃取技术结合液相色谱-串联质谱法建立了一种同时测定环境样品中19种氯酚的方法。目标化合物采用APCI源离子化和固相微萃取富集，萃取效率和离子化效率更高，适用于木头和工业废油中氯酚含量的准确灵敏检测。 Marchesex等11建立了一种采用固相萃取结合液相色谱-串联飞行时间质谱法同时测定地表水中5种氯酚的（邻氯苯酚、4-氯-3-甲基苯酚、2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚）的新方法。该方法检出限低（10 ng/L），回收率高（91%-110%）,精密度好（RSD10%）。水体中的氯酚采用HLB固相萃取柱富集和净化，取样量为2 L水，活
10、化和洗脱溶剂为甲醇，操作较简单，但取水量大，过柱时间长，不利于大批量水样的预处理。金米聪等12建立了一种简便、灵敏、准确的测定水中痕量五氯酚的固相萃取-高效液相色谱-质谱联用的检测方法,并用于生活饮用水、渔塘水中痕量五氯酚的污染监测。水样经 Oasis HLB小柱富集,以甲醇-甲基叔丁基醚(10+90)洗脱,采用甲醇和2 mmol/L 醋酸铵溶液为流动相进行梯度淋洗 ,以ZORBAX Eclip se XDB-C18柱(150 mm 211 mm 5m)分离,通过选择性离子检测(SIM)及电喷雾电离离子化技术进行测定。该方法简单快速，灵敏度高，适合地表水中五氯苯酚的测定。洪爱华等13建立了一种
11、高效液相色谱-串联四极杆质谱联用法准确、灵敏测定饮用水中五氯苯酚的方法。该方法采用 Oasis HLB 柱进行固相萃取对水样进行富集净化，不需要复杂的衍生化操作，前处理方法简便快速，并且短时间内即可得到定性、定量检测结果，适合饮用水中 五氯苯酚 含量的测定。杨秋红等14建立了简便、快速、同时测定地表水中,二 氯 酚、,三氯酚和五氯酚的固相萃取高效液相串联质谱方法。固相萃取小柱富集水样中待测物质，经二氯 甲 烷丙 酮（，）混合溶液洗脱后，氮吹浓缩，用甲醇复溶，采用高效液相色谱串联质谱检测。该方法具有灵敏度高、准确度好、精密度好、干扰小的特点，适用于集中式生活饮用水地表水水源地特定项目中的污染物的
12、检测。唐雪15建立了使用超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪联用测定生活饮用水中氯酚类物质(2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚，五氯酚)的方法。该方法生活饮用水及水源地地表水滤过后即可上机分析，无需衍生，操作简单。陈晓红等16建立了一种采用两亲性聚离子液体膜微萃取液相色谱串联质谱法测定水中种氯酚的含量。该方法操作简单，检出限低，回收率高，但所使用的两亲性聚离子液体膜材料为实验室自己合成，操作要求高，无法大规模应用于实际水体中五氯苯酚的检测。目前，有关水体中五氯苯酚测定的研究报道不断深入，但国家一直还没有渔业水体中五氯苯酚测定的液质标准，为确保环境安全与人民的身体健康，有效打击养殖中非法使用，建立
13、简便、快速、准确、灵敏度高的检测方法，测定渔业水体中五氯苯酚的检测方法显得尤为重要。1.3 研制的基本思路本方法结合国内外关于水体中五氯苯酚检测方法、文献报道及试验室的条件初步制定了渔业水体中五氯苯酚的检测方法。通过进一步优化前处理、色谱以及质谱条件，以提高检测方法的准确度和灵敏度。2现有条件农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙）通过农业部和国家技术监督局组织的双认证考核。“中心”是国家计量认证和农业部审查认可的具有第三方公正性地位的渔业水产品质量监督检验法定机构。“中心”现有17名工作人员，其中技术人员16人，硕士研究生8人，高级职称6人，中级职称7人。“中心”拥有Thermo TSQ
14、Quantum液相色谱-串联四级杆质谱联用仪、Termo Q-Exactive Focous液相色谱-高分辨质谱联用仪以及安捷伦气相色谱质谱联用仪等大中型仪器68余套台，价值近2000万元；“中心”每年不但承担了农业农村部、湖南省农业农村厅下达的检测任务，还承接了社会委托的各种检测任务，为保证我省渔业产品及渔业环境做出了应有的贡献。为保证能较好的完成渔业水体中五氯苯酚的测定 液相色谱-串联质谱法标准的制定，农业部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙）非常重视，成立编制小组，由万译文同志全面主持工作，从宏观上把握标准的制定宗旨，对标准编制小组各成员进行了明确的分工，并将责任落实到人，且定期召开标准
15、编制小组会议，及时总结实验结果。3 标准制定的依据及思路本标准制定的主要原则，一是本标准要符合国家有关方针、政策、法律和规章的要求，要符合国家强制性标准和行业标准的规定和要求；二是本标准要具有科学性、可操作性、推广型和实用性；三是本标准要能保证渔业水质的养殖用水安全，又有利于指导实际生产和产地认证工作。3.1 样品的采集及标准溶液的配制与储存水质样品的采集和制备参照SL 187水质采样技术规程进行采集。根据国内外文献中五氯苯酚标准溶液的配制方法，参照了HJ 591-2010水质 五氯酚的测定 气相色谱法五氯苯酚标准溶液的配制方法，结合本试验检测的实际情况，采用农业部环境保护科研监测所的有证标准物质（五氯酚100 mg/L）作为标准储备溶液，该溶液经逐级稀释配制成浓度为50 g/L的标准中间溶液。标准储备溶液和标准中间溶液置于-4冰柜避光中保存。临用前将标准中间溶液稀释成一系列的标准工作溶液，供上机测定。3.2 水样预处理条件的确定五氯苯酚的pKa=4.71，在中性和碱性溶液中可解离成离子形态,而在酸性溶剂中主要以分子形态存在。预处理水样酸碱度的变化会直接影响五氯苯酚的分子解离和带电荷状况，进而影响后续的HLB柱固相萃取效果。在50 mL空白水样（pH为6.85）中添加五氯苯
