《ELISA实验手册》

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1、 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 1 酶联免疫吸附试验及其应用 作者 鲍行豪 一 前 言 一 前 言 近二十几年来 免疫学分析方法发展很快 特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以 后 使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比 继 50 年代的免疫荧光 IFA 和 60 年代的放射免疫 RIA 分析技术之后 在 70 年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分 析技术 由于酶的高效生物催化作用 一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生 反应 产生了放大作用 使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别

2、出来 这种 技术被称为酶联免疫吸附试验法 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA 本法自 70 年代初期由 VAN WEEMEN SCHUARS ENGVALL 及 PERLMARN 等相继分别报道后 现已引起广泛重视 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术 现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病 寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定 根据 已经使用的结果 认为 ELISA 法具有灵敏 特异 简单 快速 稳定及易于自动化操作等特点 不仅适用于临床标本的检查 而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 因此

3、也适合于 血清流行病学调查 本法不仅可以用来测定抗体 而且也可用于测定体液中的循环抗原 所以也 是一种早期诊断的良好方法 因此 ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大 可概括四个 方面 1 免疫酶染色各种细胞内成份的定位 2 研究抗酶抗体的合成 3 显现微量的免疫沉淀反应 4 定量检测体液中抗原或抗体成份 二 方法的基本原理和种类 二 方法的基本原理和种类 ELISA 的基本原理有三条 1 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面 可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水 性部分相互吸附 并保持其免疫学活性 2 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物 而此种酶结合物仍能保持其免疫学 和酶

4、学活性 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 2 3 酶结合物与相应抗原或抗体结合后 可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反 应的存在 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的 因此 可 以按底物显色的程度显示试验结果 由于 ELISA 法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上 因而 具有特异性 而另一 方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物 它可以催化底物分子发生反 应 产生放大作用 正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性 因此 ELISA 法是一种既 敏感又特异的方法 常用的 ELISA

5、 有以下两个方面 一 测定抗原的 主要有四种方法 1 竞争法 Competition method 方法的基本原理可见图 1 本法首先将特异性抗体吸附 于固相载体表面 我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程 称为包被 Coated 也 可叫做致敏 经洗涤后分成两组 一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液 而另一组只加酶标记 抗原 再经孵育洗涤后加底物显色 这两组底物降解量之差 即为我们所要测定的未知抗原的量 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可 因此 对小分子抗原如激素和药物之类的 测定常用此法 该法的优点是快 因为只有一个保温洗涤过程 但需用较多量的酶标记抗原为其 缺点 图 1 竟争

6、法测抗原示意图 2 双抗体夹心法 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 3 方法的基本原理可用图 2 来表示 图 2 双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体 经洗涤后加入含有抗原之待测样品 如待检样 品中有相应抗原存在 即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合 经保温孵育洗涤后 即可加 入酶标记特异性抗体 再经孵育洗涤后 加底物显色进行测定 底物降解的量即为欲测抗原的量 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位 因为其一端要包被于固相载体上的 抗体作用 而另一端则要与酶标记特异性抗体作用 因此 不能用于分子

7、量小于 5000 的半抗原 之类的抗原测定 我们用在霍乱肠毒素的测定 HbSAg 及 HbS 的测定 3 改良双抗体夹心法 本法是双抗体夹心法的一种改良形式 也是用于测定抗原的 其原 理可用图 3 来表示 图 3 改良双抗体夹心法测抗原示意图 本法首先是将特异性抗体 a 包被于固相载体 经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品 经孵育 洗涤后再加一次未标记的特异性抗体 b 而这次加入的抗体 b 于第一次包被于固相载体上的特异 性抗体 a 对被测抗原来说都是特异性的 但不是用同种动物免疫制备的 否则可出现非特异性反 应 经孵育洗涤后 再加酶标记抗 b 抗体 再经孵育洗涤后加底物显色进行测定 这种方法与双

8、 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 4 抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体 因此 放大的倍数更高 故比双抗体夹心法更加灵敏 同时避免标记特异性抗体 而另一优点是只要标记一种抗抗体 即可达到多种应用 用于测定抗原的尚有第 4 种叫做抑制性测定法 见图 4 它是先用抗原包被固相载体 然后 分为二组 一组加入用参考抗体和被检标本混合孵育后的混合溶液 假如标本中不含抗原 则参 考抗体未被结合 因此它可以和包被于固相载体上的抗原结合 如标本中含有抗原 则抗原先与 参考抗体结合 故参考抗体不再与包被于固相载体上的抗原结合 对加入酶结合物 抗球蛋白

9、 和底物仅显示剩余结合的抗体量 再与另一组不加待检标本的参考系统比较 被检标本对底物显 色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例 二者之差 即为欲测抗原的量 图 4 抑制性测定法的原理 被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成比例 二者之差即为欲测抗原的 量 二 测定抗体方面 所用的方法称为间接法 也是目前最常用的方法 其原理可用图 5 来表 示 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 5 图 5 间接法测抗体示意图 间接法首先用抗原包被于固相载体 这些包被的抗原必须是可溶性的 或者至少是极微小的 颗粒 经洗涤 加入含有被测抗体之标本

10、 再经孵育洗涤后 加入酶标记抗抗体 对人的标本 来说即加酶标抗人球蛋白 IgG IgM 再经孵育洗涤后 加底物显色 底物降解的量 即为欲测抗 体的量 其结果可用目测或用分光光度计定量测定 本法用不同种抗原包被固相载体后 只要用 一种酶标记抗人球蛋白 即可作多种人的传染病 寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断 如用酶 标记抗人 IgM 则可用于早期诊断 三 ELISA 的影响因素 三 ELISA 的影响因素 这是 ELISA 检测中的重要部分 可从 9 个方面加以说明 一 固相载体 可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式 这是进行酶标记测定 的基本条件 许多物质可作为固相载体 如纤维素 交联右

11、旋糖苷 琼脂糖珠 聚丙烯 聚苯乙 烯 聚乙烯及聚氯乙烯等等 但在 ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管 由于微量反应板所用试剂量少 操作方便 适合于大规模应用 国产聚苯乙烯微量反应板 上海 塑料三厂出品 目前已大量应用于 ELISA 测定 并且获得了满意的结果 但每批微量反应板对抗 原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的 实验证明 吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性 质有关 特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差 异 甚至完全丧失吸附能力 因此 对每批制品在使用前 必须经过实验室鉴定 鉴定的方法和 标准是对每批购置的微量反应板或塑料

12、管抽样 用 0 2ug ml 纯化的正常人 IgG 进行包被 经洗 涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应 再经孵育洗涤 加底物显色终止反应后 逐孔在酶标比色计 中测定其消光值 光密度 O D 值 一般认为全板中每两孔间 O D 值的误差不超过 10 为合格 如果中间孔与四周孔 O D 值相差太大 或者反应板的这一边与另一边凹孔的 O D 值相差大 均不 合格 此外 还要检查阳性和阴性参考血清 O D 值是否有明显差别 一般要求有 10 倍左右的差 异为合格 微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理 用蒸馏水冲洗即可应用 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail

13、master 网址 6 二 抗原 在 ELISA 中 包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果 都有影响 包被所用的抗原必须是可溶性的 而且要求是优质和稳定的制剂 纯度和免疫原性要 高 如果不纯 由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置 降低敏感性和特异性 此 外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性 经试验证明 适用于其他血清学试验的抗原 并非均适合用于 ELISA 法 因此 对某一疾病的诊断 必须通过实践 才能选出适用的优质抗原 对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格 一般能用于补体结合 试验的可溶性抗原均可用于 ELISA 例如超声波抗

14、原 冻融抗原 细菌的外膜抗原 脂多糖 LPS 细菌的外毒素以及用表面活性剂 如 SDS 所提取的抗原等 在作 ELISA 时 必须要有 1 2 种试剂 要求纯化 但用表面活性剂提取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂 否则就不易吸附到固 相载体上去 此外 对某些抗原必须进行提纯 如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动 物的脏器等 它们当中存在着许多非抗原的蛋白质 必须设法除去 常用梯度超速离心或亲和层 析法提纯 不经提纯是不能使用的 在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯 用抗原或抗体蛋 白包被固相载体时选择的浓度要适当 如浓度太高 则低效价抗体可能测不出来 或包被过量形 成多层抗原吸附 故

15、在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性 用最适稀释度抗原 包 被固相载体不仅经济 而且可以克服前带现象 那么用多大浓度抗原进行包被最为合适呢 可通 过棋盘滴定法进行测定 但用单项滴定法更为简便 其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反 应板 再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤 再加酶结合物进行反应 经孵育洗涤后 加底物溶液显色 终止反应后分别测定 O D 值 选择 O D 值 1 0 的那个抗原稀 释度为最适包被浓度 一般总是要选择那个 O D 值稍大于 1 0 而不选择小于 1 0 的抗原浓度 阴性参考血清 O D 值要求 Fe E N C CH2 3 C N Ig

16、 2H2O CH2OH CH2OH 酶 低聚醣基团 戊二醛 免疫球蛋白 酶结合物 水 用戊二醛标记又可分为一步法和二步法 一步法主要是将酶 抗体球蛋白和戊二醛同时混合 热线电话 021 6485 8053 8009881995 E mail master 网址 9 而直接制备 此法虽然简单 但因酶蛋白的活性氨基少 免疫球蛋白的活性氨基多 在戊二醛作 用下 容易形成免疫球蛋白的聚合物 当然也可形成酶蛋白的聚合物 因而 形成酶标记抗体的 比例较少 同时抗体和酶的活性丧失较多 结合物的酶活性较低 但较简便 戊二醛二步法中先 用过量的戊二醛与酶作用 使戊二醛上的一个活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合后 除去过 量戊二醛 可通过葡聚糖凝胶 G 25 过柱或用透析法除去 然后 再加入抗体球蛋白 使之与酶 戊二醛复合物反应 形成酶结合物 而酶结合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如赖氨酸 除去 于稳定酶结合物的特异性 在戊二醛二步法中 酶本身并不产生缩合 因为在第二步酶分 子上的一个游离氨基仅与戊二醛上的一个活性醛基联结 而戊二醛上另一个活性醛基则可与第二 步加入的抗体球蛋白分子上的氨基结合生成酶结