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1、专题二 微生物的培养和应用课题1 微生物的实验室培养一、基础知识：（一）培养基1培养基是人们按照微生物对营养物质的需求不同而配制出供其生长繁殖的营养基质，培养基的种类包括固体培养基和液体培养基等。2琼脂是从红藻中提取的多糖，在配制培养基中用作为凝固剂。【开拓视野1】培养基的类型（记忆）及其应用分类标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多菌种分离、鉴定、计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保存液体培养基不加入琼脂工业生产的连续培养化学组成合成培养基由已知化学成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确用于工业生产降低成本目的用途鉴别培养
2、基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加（或缺少）某种化学成分菌种的分离3各种培养基的用途培养基名称应用培养基名称应用牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌查氏培养基培养霉菌营养琼脂培养基培养细菌MY培养基霉菌和酵母菌传代保藏麦芽汁琼脂培养基培养酵母菌尹红美蓝培养基检测水中大肠杆菌含量马铃薯琼脂培养基培养真菌MS培养基用于植物组织培养4培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源四类营养成分。此外，培养基还要满足微生物生长的pH、特殊营养物质和氧气等要求。【开拓视野2】有机营养成分及其作用碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等含碳有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨盐、硝酸盐
3、、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。生长因子：某些微生物正常生长代谢中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。其中，含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。【思考1】牛肉膏和蛋白胨的作用是？答：主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质。【思考2】培养乳酸杆菌、霉菌、和细菌时各有什么特殊要求？答：培养乳酸菌时需要添加维生素；培养霉菌时需要将培养基pH调节为酸性；培养细菌时需要将pH调节为中性或微碱性。（二）无菌技术1获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。2无菌技术包括：对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁
4、和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。3比较消毒和灭菌比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能【思考3】无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有什么目的？答：防止感染实验操作者。（三）实验室常用的消毒和灭菌方法1消毒方法：生活经常用到的是煮沸消毒法；对一些不耐高温的液体则用巴氏消毒法；对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液，然后使用紫外线进行物理消毒；实验者的双手使用酒精进行消毒；饮水水源用氯
5、气进行消毒；肌肉注射时所用的皮肤消毒剂有酒精、碘酒；皮肤擦伤后所用的消毒剂有结晶紫、红汞、H2O2等。2灭菌方法：接种环、接种针、试管口等用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用具等用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱； 培养基、无菌水等用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；3利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能太挤，目的是避免妨碍热空气流通。4高压蒸汽灭菌法：物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内的冷空气，目的是有利于锅内温度升高；随后关闭排气阀继续加热，气压升至100kPa，温度为121，并维持1530min；切断热源使温度自然降温，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防
6、止容器中的液体暴沸。二、实验操作（大肠杆菌的纯化培养）（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算100mL培养基各成分用量。2称量：牛肉膏较黏稠，可用玻棒挑取，同称量纸一同称量。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。3溶化：加水加热熔化牛肉膏与称量纸取出称量纸加入蛋白胨和氯化钠继续加热加入 用蒸馏水定容到100mL（整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂）。4灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。5倒平板：待培养基冷却至50左右时在酒精灯火焰附
7、近操作进行。其过程是：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。【思考4】培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么方法估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了【思考5】为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。【思考6】平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以
8、使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。【思考7】在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌1方法：微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目
9、的。将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划35条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。将平板倒置放在培养箱中培养。【思考8】为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌
10、种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。【思考9】在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。【思考10】在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（2）稀释涂布平板法：系列稀释操作：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到
11、琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推，直到最后一步完成。涂布平板操作将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液（不超过0.1mL），滴加到培养基的表面将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均匀涂步在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。【思考11】涂布平板的所有操
12、作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。2培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12h和24h后分别观察并记录结果。三、结果分析与评价1未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？答：未接种的培养基在恒温培养箱中保温12后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则要重新制备。2在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的菌落？这些菌落的颜色、形状和大小相似吗？答：如果
13、接种成功的话，在培养基的表面可以观察到颜色、形状和大小相似的菌落。3培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，情分析产生差异的原因？答：菌落大小明显不同。随着时间的延长，菌落不断生长，使菌落不断变大。4如果在培养基上观察到了不同形态的菌落，请分析其可能的原因。答：无菌操作未达到要求，可能的原因有：培养基灭菌不彻底，接种时发生污染，培养过程中发生污染。四、课题延伸菌种保藏：1临时保存：频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，即将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适温度下培养，菌落长成后，将试管放入4的冰箱中保藏。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。2长期保存：菌种
14、的方法是甘油管藏法，即在3mL的甘油瓶内，装入1mL甘油后灭菌，将1mL培养的菌液转移到甘油瓶内，与甘油混合均匀后，放入-20的冰箱中保存。五、巩固练习1下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是：A防止杂菌污染 B消灭杂菌C培养基和发酵设备都必须灭菌 D灭菌必须在接种前2将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱的目的是：A对比观察培养基有没有被微生物利用 B对比分析培养基是否被杂菌污染C没必要放人未接种的培养基 D为了下次接种时再使3有关微生物营养物质的叙述中，正确的是：A是碳源的物质不可能同时是氮源 B凡碳源都提供能量C除水以外的无机物只提供无机盐 D无机氮源也能提供能量4下列物质中，不能用作酵母菌碳源的是：A含碳有机物 B蛋白胨 C含碳无机物 D花生粉饼等天然物质5有关稀释涂布平板法，叙述错误的是：A首先将菌液进行一系列的梯度稀释B然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C再放在适宜条件下培养D结果都可在培养基表面形成单个的菌落6平板冷却凝后要将平板倒置，其意义是：A利于大肠杆菌的接种 B防止杂菌污染 C利于培养的冷却 D防止皿盖冷却水倒流入培养基7微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。
