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1、DNA测序仪的原理及应用测序仪的原理及应用 上海交通大学分析测试中心上海交通大学分析测试中心 侯敬丽侯敬丽 内容内容 DNA测序原理 CEQ8000 DNA测序仪 基因测序系统的应用 基因组DNA 染 色体 质粒DNA 细菌 细胞 线粒体DNA 胞浆 人工染色体DNA BAC YAC cDNA 引引 双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法 1977年 Sanger等人发展建立起来的一种DNA 测序方法 基本原理 基本原理 双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂 类似 于正常dNTP的2 3 双脱氧核苷三磷酸 ddNTP 将 延伸的DNA链特异性地终止 其反应体系也包括单 链模板 引物 4种dNTP和
2、DNA聚合酶 共分四 组 每组按一定比例加入一种 ddNTP 它能随机 渗入合成的DNA链 一旦渗入合成即终止 于是各 种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸 可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意双脱氧链末端终止法测序基本原理示意 双脱氧链末端终止法特点双脱氧链末端终止法特点 双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的 优点 而且更适用于大规模的测序 但它要求有 一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特 异性的引物 因此 早期的工作仅局限于单链噬 菌体为模板 若干个不同的特定限制性内切酶酶 解片段为引物 在模板链的不同部位引
3、导合成 从而确定出噬菌体DNA的核酸序列 然而 对于大 量存在着的天然双链DNA分子 因没有良好的制备 产量和质量高的分离链的技术 而限制了双脱氧 链末端终止法的应用程度 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 标记物方面的改进 标记物方面的改进 由于放射性同位素对人 体的危害 许多实验室开始利用非放射性物质 来取代放射性同位素 如生物素 地高辛 银 染法 荧光标记物等化学发光物 生物素 地高辛 银 染法 荧光标记物等化学发光物 在双脱氧法 测序时 它们作为标记物 示踪测序反应的产 物 最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出 测序的结果 这些方法比传统
4、的放射性同位素 方法检测容易 安全 快速 费用也低 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 经典的双脱氧链末端终止法 测序技术的改进 电泳方法的改进 电泳方法的改进 电泳方法的改进主要采用毛细 管电泳法 毛细管电泳毛细管电泳是被分离物质在毛细管中 的电泳 1992年 Matnies等首先提出陈列毛细管 电泳法 采用激光聚焦荧光扫描检测装置 25只 毛细管并列电泳 每只毛细管在1 5小时内可读出 350bp DNA序列分析效率可达6000bp h 双脱氧链末端终止法测序基本原理示意双脱氧链末端终止法测序基本原理示意 DNA测序仪测序原理测序仪测序原理 Sanger DNA测序仪的发展历程测序仪
5、的发展历程 1977 Sanger DNA法测序概念被提出 1986 Hood and Smith 荧光标记ddNTP被用于电泳 1987 第一台自动测序仪产生 1990 毛细管电泳被应用在DNA测序上 2003 人类基因组测序工作完成 G A T C CCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCC CEQ8000 DNA测序仪 CEQ8000DNA测序仪硬件预览 Capillary Array Diode lasersDetection window Filter wheel PMT Gel Cartridge Automated Sample Denaturation an
6、d Injection Beckman CEQ8000 Start menu Alignment Analyzed Data Quality Parameters Base Sequence Raw Data Current Voltage View a SEQ ResultView a SEQ Result 质粒和质粒和PCR产物测序产物测序 仪器性能 CEQ 基因分析系统是一个全自动的系统 能够测定经过 Beckman Coulter 染料标记试剂处理的DNA样品的碱基序列和 片段长度 四色染料标记终止反应试剂盒用于对样品进行碱基 序列分析 染料标记引物则用于对样品产生的片段长度进行分析
7、CEQ8000 可一次接受 1个 96 孔板 包括标记 DNA 片段的每 排 8 个样品 样品设置 自动变性 接着被毛细管电泳分离 每次分离之后 在 8 根毛细管中的可替换媒介 分离胶 都被 自动替换 分离胶是由一个容易替换的胶管供给的 它能有效的 供应 1 块96孔板 检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的 分离之后 8 根毛细管中的每根产生的原始数据信号都自动处理产生高质量 的碱基序列或片段序列 原始数据和分析数据储存在数据库里 都能够以与普通分析应用程序兼容的格式输出 1 分离纯化模板DNA 2 DNA模板定量分析 3 测序反应 4 测序反应后纯化 5 On line变性 6 毛细
8、管电泳和检测 7 数据分析 测序过程测序过程 DNA Sequencing with GenomeLabTM 测序过程测序过程 DNA Sequencing with GenomeLabTM 分离纯化模板DNA分离纯化模板DNA 1 应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到 相应的质粒模板或者PCR产物 2 将DNA储存在灭菌水里如ddH2O 18 2M H2O超纯水 注意 注意 不要使用DEPC处理的水 水中不能有 EDTA 否则将抑制测序反应 3 通过紫外分光光度计定量DNA模板 DNA模 板的浓度应该 0 1ug ul 4 通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量 准确定量准确定量DNA模
9、板是测序反应中十分重要的一步模板是测序反应中十分重要的一步 测序反应测序反应 测序反应后纯化测序反应后纯化测序反应后纯化测序反应后纯化 去掉反应产物中的去掉反应产物中的dNTP ddNTP和盐分和盐分 乙醇沉淀乙醇沉淀 利用利用96孔板离心机 孔板离心机 G C G C T A Mg Mg Mg Mg Mg Mg G C A T T A A T A T 纯化得到纯化得到 DNA 测序反应产物测序反应产物 测序反应后纯化测序反应后纯化 激光诱导的荧光终止剂被 检测器识别 直接阅读DNA 的核苷酸序列 激光诱导的荧光终止剂被 检测器识别 直接阅读DNA 的核苷酸序列 DNA测序仪检测测序仪检测 荧
10、光标记的荧光标记的DNA链按从小 到大的顺序被毛细管电泳 分离 链按从小 到大的顺序被毛细管电泳 分离 Standard Kit Sequencing Reaction Buffer dNTP Mix ddUTP ddGTP ddCTP ddATP Dye Terminators Polymerase Enzyme Sample Loading Soln SLS DTCS Kits Store at 20 C Quick Start Kit Everything mixed Except SLS Save time cost Eliminate waste from carry over Ty
11、pical Sequencing Result 基因测序系统的应用基因测序系统的应用 测序测序 PCR克隆测序验证克隆测序验证 突变体检测突变体检测 新基因测序新基因测序 全基因组测序全基因组测序 系统发育及物种鉴定系统发育及物种鉴定 个体识别 亲缘鉴定个体识别 亲缘鉴定 SNP关联分析关联分析 疾病诊断等疾病诊断等 片段分离片段分离 PCR克隆测序验证克隆测序验证 突变体检测突变体检测 新基因测序新基因测序 BAC克隆或克隆或YAC克隆去筛选克隆去筛选cDNA文库文库 找出候选基因找出候选基因 精确定位法 检查cDNA是 否与目标基 因共分离 测定cDNA序 列 查询数 据库 以了 解该基因
12、的 功能 测定cDNA序 列 查询数 据库 以了 解该基因的 功能 检查cDNA 时空表达 特点是否 与表型一 致 筛选突变体 文库 找出 DNA序列上 的变化及与 功能的关系 进行功能互补 实验 通过转 化突变体观察 突变体表型是 否恢复正常或 发生预期的表 型变化 图位克隆法分离新基因图位克隆法分离新基因 全基因组测序全基因组测序 细菌 DNA病毒 Cosmid Plasmid 微生物 1000多种病毒 135种细菌 16种古细菌的测序已经基本完成 动物 植物基因组 动物 人类 老鼠 果蝇 丝盘虫 甲虫等 植物 拟南芥 水稻 毛果杨 大豆 基于线粒体COI基因部分序列构建梭子蟹系统发育树
13、研究各 种梭子蟹系统发育和亲缘关系 并且对样品蟹的种类进行鉴定 系统发育及物种鉴定系统发育及物种鉴定 Marine Sciences 2008 Vo1 32 No 4 9 AGC AGC AGC AGC AGC AGC AGC Up to 1000 Repeats 2 10 bases 短串联重复 短串联重复 Short Tandem Repeat STR 简单序列重复 简单序列重复 Simple Sequence Repeat SSR 可变数目串联重复 可变数目串联重复 Variable number Tandem Repeat VNTR 微卫星序列 微卫星序列 Microsatellite
14、 In all genomes Human Animals Plants Microbes STR SSR VNTR Microsatellite 个体识别 亲缘鉴定个体识别 亲缘鉴定 PCR CEQ PCR CEQ Analysis of STR SSR Microsatellite Heterozygote Person 1 Homozygote Person 2 PCR CEQ PCR CEQ STR微卫星标记的片断分析微卫星标记的片断分析 Human STR Primer Kit Single Nucleotide Polymorphism SNP SNP关联分析关联分析 单核苷酸多态
15、性 碱基插入 缺失 突变等原因造成 Primer Extension Technology The Genotyping Gold Standard Detect function Anneal Simple Primer Extension Extend Accurate lock and key enzyme Detect Fluorescence Primer Extension Technology A T T A 123 ACT A A T C G T A SNP 1 SNP 3 SNP 2 SNP检测策略检测策略 Allele 2 Allele 2 GTAGGAGGACAGATAA
16、AGAAGC Allele 2 GTAGGGGGACAGATAAAGAAGC Allele 1 Person 1Person 2Person 3 Allele 1 Allele 1 Allele 1 Allele 2 HomozygoteHeterozygote Homozygous templateHeterozygous template Microsatellite Instability MSI or MI in Cancer Different Tissues from the Same Patient in Tumor tissue in Normal tissue 疾病诊断疾病诊断 PCR CEQ Loss of Heterozygosity LOH in Cancer PCR CEQ PCR CEQ Heterozygote in Normal tissue Non Heterozygote in Tumor tissue Different Tissues from the Same Patient 疾病诊断疾病诊断 总结 Sanger DNA测序原理 Beckman
