《动物组织RNA提取及荧光定量PCR 精讲》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物组织RNA提取及荧光定量PCR 精讲（30页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、RNA提取及Q PCR相关技术 主讲 宋志新 利用含有变性剂和Rnase抑制剂的有机溶剂提取RNA 是目前常用的RNA提取方法 Trizol 主要成分为异硫氰酸胍和酚 具有极强的裂解能力 可在短时间内裂解细胞和组织样本 保持样品中RNA的完整性 有效抑制RNA的降解 样品在TotalRNAExtractionReagent中能够充分被裂解 在加入氯仿离心后 溶液会形成上清层 中间层和有机层 鲜红色下层 RNA分布在上层水相中 收集上清层后 经异丙醇沉淀便可以回收得到TotalRNA 提取的总RNA纯度高 基本不含蛋白质及基因组DNA 提取的RNA可直接用于Northern 点杂交 mRNA纯化
2、 体外翻译 RT PCR 以及构建cDNA文库等各种分子生物学实验 TotalRNAExtractionReagent广泛适用于培养细胞 动物组织 微生物等 下面介绍动物组织TotalRNA的提取方法 RNA提取 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 概要 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 实验材料1 组织 以小鼠肝脏为例 2 RNAisoPlus CodeNo 9108 作用同TRIzol 3 其他 氯仿 异丙醇 75 乙醇 研钵 加样器 1 5mlEP管 枪头等 均为RNase free 0 1 DEPC水 有毒 RNA提取 概要 RT P
3、CR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 准备工作戴口罩 手套 帽子提取区域 用75 乙醇擦拭试验台试验器具 用75 乙醇擦拭加样枪准备RNase free的枪头和离心管低温离心机预冷至4 准备 20 预冷的75 乙醇 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提取步骤1 从小鼠体内取出肝脏 用预冷的生理盐水清洗 2 使用液氮迅速冷冻组织 80 冰箱保存 3 使用液氮充分预冷研钵 4 将称重冷冻的组织 约50 100mg 从冰箱取出后迅速放入预冷好的研钵中 用研杵研磨组织 期间不断加入液氮 直至组织被研磨成粉末状 注 无明显的可见颗粒 如果研磨不彻底会影响
4、RNA的收率和质量 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提取步骤5 向研磨成粉末状的样品中加入1mlRNAisoPlus 并完全覆盖样品 注 在加入RNAisoPlus时要保证组织没有融化 否则RNA易被RNase降解 6 室温静置5 10min 7 待样品融化后 用研杵继续研磨至裂解液呈透明状 将匀浆液转移至1 5mlEP管中 室温静置5min后 4 13000rpm离心5min 将上清转移至新的1 5mlEP管中 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提取步骤8 每1ml液体中加入1 5体积 约200 l 的
5、氯仿 盖紧EP管 用手剧烈震荡15秒 直至溶液充分乳化 无分相现象 注 不能用振荡器混匀 因为容易造成DNA和RNA的物理降解 9 室温静置5min 4 13000rpm离心15min 10 从离心机中小心取出EP管 此时匀浆液分为三层 上层是透明的水层 RNA溶解在此层中 半固体状的中间层 此层中包含DNA 下层为粉红色的有机溶剂 蛋白质 多糖等物质溶解在此层中 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提取步骤11 将上层水相溶液小心转移至新的EP管中 大约每个EP管中能取出400 500 l 谨慎操作 切勿吸到中间层 注 下层有机废液勿乱丢 收集起来统
6、一进行无毒化处理 12 加入等体积异丙醇 上下颠倒EP管 充分混匀 13 室温静置10min后 4 13000rpm离心10min 可在离心后的EP管底部观察到少量的白色沉淀 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提取步骤14 小心弃去上清 15 向含有沉淀的EP管中缓缓加入1ml预冷75 乙醇 轻轻上下颠倒 清洗沉淀 动作轻柔 无需将沉淀悬浮起来 16 4 13000rpm离心5min 用移液器除去上清 17 将EP管瞬时离心 用移液器仔细将残存在EP管底部的少量液体除去 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的提
7、取步骤18 打开EP管 室温放置干燥 目的是让残留的乙醇挥发 乙醇的残留可能对后续的反应有影响 干燥的时间不宜太久 RNA完全干燥后很难溶解19 用RNase freeddH2O溶解沉淀 视RNA量的多少所加RNase freeddH2O的体积从20 200不等 肝脏组织RNA产率较高 肺组织产率低 20 RNA溶液保存在 80 冰箱中 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的浓度及质量检测1 浓度及纯度检测 ThermoSCIENTIFICNANODROP1000Spectrometer 核酸在260nm附近有强吸收 蛋白质在280nm附近有强吸收 所以
8、测定溶液在260nm和280nm下的吸光度 根据A260计算提取的核酸量 根据A260 A280的比值评价提取的核酸纯度 理想的RNA纯度A260 A280应在1 8 2 2范围内 低离子强度或低pH值会使OD280升高 从而使OD260 OD280值低 1 65 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的浓度及质量检测2 质量检测 凝胶电泳法利用1 的琼脂糖凝胶进行电泳 如果可以清晰观察到两条rRNA条带 真核生物 28S和18S 原核生物 23S和16S 且其浓度比值大约为2 1 则RNA未降解 若观察到smear现象 或比值小于2 1 则RNA已发生降
9、解 如果观察到大于28S或23S的条带 则样品可能有基因组DNA污染 这时可以考虑使用DNaseI处理 若有条带 可能混入了基因组DNA 28SrRNA 18SrRNA tRNA等 DL2000DNAMarker电泳图 1 琼脂糖胶 TAE RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的浓度及质量检测2 质量检测 凝胶电泳法实验材料 a 提取的RNA溶液b DL2000DNAMarkerc 6 LoadingBufferd 1 的琼脂糖凝胶 加1 lGoldview 20ml凝胶 e 1 TAEBufferf 电泳仪g UV凝胶成像仪 RNA提取 概要 RT P
10、CR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的浓度及质量检测2 质量检测 凝胶电泳法实验操作 1 取10 lRNA原液至一个1 5mlEP管中 使用RNase freeddH2O将其稀释至200ng l 注 需RNase freeddH2O体积 l 10 l RNA浓度 ng l 200 ng l 10 l2 取5 lRNA 200ng l 至一个小EP管中 以供电泳使用 注 剩余部分于 80 保存备RT反应用 3 将上步的RNA70 加热2min 4 冰上冷却 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA的浓度及质量检测2 质量检测 凝胶电泳法实验操作
11、5 向每管中加入1 l6 LoadingBuffer 混合均匀 6 将琼脂糖凝胶放入到电泳槽中 7 导入1 TAEBuffer 完全浸过胶面 8 点样 将管内样品全部加入到一个凝胶孔里 9 电泳 100 120V 约20 30分钟 10 凝胶成像 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA产率估计 RNA提取 概要 RT PCR Q PCR 注意事项总结 RNA提取 RNA降解 巨噬细胞RNA 巨噬细胞RNA 动物组织RNA 逆转录PCR RT PCR 概要 RNA提取 RT PCR 注意事项总结 Q PCR 反转录 RT 反应RNA自身不能作为PCR反应的模
12、板 所以必须先将其反转录为cDNA 实验操作 1 将提取的RNA调整浓度为500ng l 并于70 变性2min 2 配反应体系 注意 不同的试剂盒体系不同 我们用的是TaKaRa的RR037A 20 l体系5xBuffer4 lOligodTPrimer1 lRandom6mers1 lDEPCH2O1 lEnzymermix1 l提取的RNA模板2 l 逆转录PCR RT PCR 概要 RNA提取 RT PCR 注意事项总结 Q PCR 反转录 RT 反应实验操作 1 RT PCR程序 37 15min85 5s4 反转录过程 使反转录酶失活 得到的cDNA短期可在4 保存数天 长期保存应
13、在 20 以下 荧光定量PCR Q PCR 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时在线监测整个反应进程 并结合相应的软件对未知模板进行定量分析的方法 荧光定量PCR Q PCR 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 荧光定量PCR Q PCR 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 荧光定量PCR Q PCR 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 QPCR 双标记探针 TaqmanProbe 荧光报告基团 Reporter 荧光淬灭基团 Quencher 序列特异性
14、 寡核苷酸探针 游离状态下 FRET效应 不发荧光 伴随产物生成 荧光积累 双标记探针 TaqmanProbe 荧光定量PCR Q PCR 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 QPCR 注意事项总结 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 常见问题及疑难解答提取RNA收率低当收率明显低于预期时 可以考虑以下原因 1 加入Trizol或RNAisoPlus后样品匀浆不充分 2 分层时水相回收率低 3 RNA沉降后与水复溶性不好 4 异丙醇沉降或洗涤过程中混入Rnase 注意事项总结 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 常见问题及疑难解
15、答提取的RNA难以溶解1 75 乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥 2 若难溶可以于60 加热5分钟后再于冰上溶解数小时 注意事项总结 概要 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 常见问题及疑难解答提取的RNA降解1 提取RNA应采用新鲜的组织材料 或者用液氮迅速冷冻后置于 80 保存的组织材料 2 提取RNA使用的试剂及器具中可能混有Rnase 3 提取的组织材料中含有大量的Rnase 提取时应提高Trizol或RNAisoPlus的使用量 4 RNA提取应有专门的区域 使用无酶的枪头 EP管 带口罩 帽子 手套 并在操作中更换新手套 跑电泳时每次将槽子洗干净 换新的TAE缓冲液 Thankyou RNA提取 RNA提取 RT PCR Q PCR 注意事项总结 概要 宋志新Tel 15922761761
