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1、弧菌和弯曲菌 医学检验系临床微生物及免疫学教研室井申荣 第一部分弧菌 概述 弧菌科 Vibrionaseae 包括一群氧化酶阳性 具有端极鞭毛 动力阳性的细菌 有4个菌属 其中 弧菌属是一群氧化酶阳性 发酵葡萄糖 对弧菌抑制剂O 129 二氨基二异丙基喋啶 敏感的细菌 弧菌属 Vibrio 广泛分布于自然界 尤以水中为多 有100多种 主要致病菌为霍乱弧菌和副溶血弧菌 致病性嗜盐菌 前者引起霍乱 后者引起食物中毒 霍乱弧菌 霍乱弧菌 V cholera 是人类霍乱的病原体 霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一 曾在世界上引起多次大流行 主要表现为剧烈的呕吐 腹泻 失水 死亡率甚高 属于国际
2、检疫的烈性传染病 霍乱弧菌包括两个生物型 古典生物型 Classicalbiotype 和埃尔托生物型 EL Torbio type 这两种型别除个别生物学性状稍有不同外 形态和免疫学性基本相同 在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别 自1817年以来 全球共发生了七次世界性大流行 前六次病原是古典型霍乱弧菌 第七次病原是埃尔托型所致 1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株 0139 它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同 但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集 该菌株在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长 因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株 一
3、生物学性状 一 形态染色 霍乱弧菌呈弧形或逗点形态 大小为1 4 2 6 0 5 0 8 m 革兰氏阴性菌 菌体一端有单根鞭毛和菌毛 无荚膜与芽胞 取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察 可见细菌运动极为活泼 呈流星穿梭运动 图注 霍乱弧菌的鞭毛 和它可溶解的鞘膜 负染 3100 图注 分裂中的霍乱弧菌冰冻蚀刻 70000 二 培养特性 霍乱弧菌为需氧或兼性厌氧菌 营养要求不高 耐碱不耐酸 在pH8 8 9 0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好 因其他细菌在这一pH不易生长 故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基 在碱性平板上菌落直径为2mm 圆形 光滑 透明 常用的选择培养基为硫代硫酸盐
4、枸橼酸盐 胆盐 蔗糖琼脂平板 TCBS 霍乱弧菌在其中可形成较大的菌落 因发酵蔗糖产酸而使菌落呈黄色 三 生化反应 两个生物型的霍乱弧菌都能分解甘露醇 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 产酸不产气 迟缓发酵乳糖 不分解阿拉伯糖 氧化酶 明胶酶试验均阳性 能产生靛基质 霍乱红反应阳性 ElTor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同 ElTor型V P试验为阳性 能产生强烈的溶血素 溶解羊红细胞 在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环 古典型试验V P试验为阴性 不溶解羊红细胞 个别ELTor型霍乱弧菌株亦不溶血 四 抗原性1 抗原结构 2 分群和分型 根据O抗原的特异性 可将霍乱弧菌分成139个
5、血清群 根据是否与O1抗血清凝集分两大群 凡能与O1群抗血清发生凝集的称为O1群霍乱弧菌 凡不被O1群抗血清凝集的其它血清群统称为非O1群霍乱弧菌 血清型 O1群霍乱弧菌的菌体抗原由A B C三个抗原成份组成 生物型 O1群霍乱弧菌有古典生物型和E1Tor生物型之分 两个生物型具有相同的血清型 我国流行以ElTor 小川型霍乱弧菌为主 噬菌体分型 对噬菌体的敏感性进行分型 其中较为实用的是第 组和第 组噬菌体 以上为阳性 以上为阴性 阳性 五 变异性 六 抵抗力 霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱 EL Tor生物型抵抗力较强 霍乱弧菌对热 干燥 日光 化学消毒剂和酸均很敏感 耐低温 耐碱而
6、不耐酸 霍乱弧菌对链霉素 氯霉素和四环素敏感 但ElTor生物型对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉素有耐药性 二 致病性和免疫性1 致病物质 1 鞭毛 菌毛 粘液素酶 2 霍乱肠毒素 choleraenterotoxin 霍乱肠毒素本质是蛋白质 不耐热 对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗 该毒素属外毒素 具有很强的抗原性 致病机理 霍乱弧菌 胃 对酸敏感 很快被杀死 肠 胃酸降低或缺乏 菌体增多 鞭毛 菌毛 粘液素酶 绒毛上大量繁殖 CT的B亚单位结合神经节苷脂受体 形成膜通道 A1肽链进入细胞 ATP cAMP 肠粘膜上皮细胞分泌亢进 肠液大量分泌 大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻 大量脱水和失
7、盐 发生代谢性酸中毒 血循环衰竭 甚至休克或死亡 激活腺苷酸环化酶系统 2 所致疾病 引起烈性肠道传染病的霍乱 为我国的法定传染病 甲类 表现为剧烈的上吐下泻 导致严重的脱水 酸中毒 痉挛 尿闭 休克和死亡 人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者 主要通过污染的水源或饮食物经口传染 粪口途径 患者出现上吐下泻 泻出物呈 米泔水样 并含大量弧菌 此为本病典型的特征 3 免疫性 患过霍乱的人可获得牢固的免疫力 再感染者少见 病后小肠内可出现分泌型lgA 三 微生物学诊断 由于霍乱流行迅速 且在流行期间发病率及死亡率均高 危害极大 因此早期迅速和正确的诊断 对治疗和预防本病的蔓延有重大意义 一 标本
8、采集 标本以粪便为主 一般米泔水样便采取1 3ml 成形便采取蚕豆大小 在某些情况下 亦可采取呕吐物和尸体肠内容物作检材 检验程序 三 检验方法及鉴定1 直接镜检 1 动力观察 采取病人 米泔水样 大便或呕吐物制成悬滴片 观察细菌动力 可见流星或穿梭状动力的细菌 2 制动试验 标本 霍乱多价诊断血清 效价1 64 用暗视野镜观察 3分钟内运动被抑制的即为阳性 此法优点是快速而特异操作简便 但必须有数量较多的弧菌才检出 3 涂片染色 革兰氏染色阴性并成鱼群状排列的弧菌 2 快速诊断 1 免疫荧光菌球法 将标本接种于含有霍乱弧菌荧光抗体的碱性蛋白胨水中 经37 4 6h 如有霍乱弧菌 在荧光显微镜
9、下可见发荧光的菌球 本法适用于做大量标本的初筛 2 SPA协同凝集试验 以霍乱弧菌IgG型抗体与SPA阳性葡萄球菌结合作为试剂 与米泔水样便或增菌液作玻片凝集 立即出现明显凝集者 为阳性 3 细菌分离培养1 直接分离培养 分离用的培养基有强 弱2种选择培养基 弱选择培养基 碱性琼脂和碱性胆盐琼脂 强选择培养基 常用的有庆大霉素琼脂 4号琼脂和TCBS琼脂等 现多采用碱性蛋白胨水增菌 再用强选择培养基进行分离 4 鉴定 根据霍乱弧菌在各种选择培养基上的特点 挑选可疑菌落进行鉴定 鉴定以血清学 玻片凝集 为主 结合形态学 生化反应作出判断 1 玻片凝集试验 从分离培养基上挑取可疑菌落于霍乱弧菌多价
10、诊断血清作玻片凝集试验 诊断血清应稀释成1 32 1 64的效价使用 立即出现凝集者为阳性 同时设生理盐水和阳性细菌株对照 2 形态学检查 取纯培养物涂片革兰氏染色 观察菌体形态及染色性 用悬滴法或半固体穿刺法检测动力 3 生化反应 霍乱弧菌氧化酶试验 靛基质试验 粘丝试验和霍乱红试验均阳性 粘丝试验 用于测定霍乱弧菌形成粘丝的特性 将0 5 去氧胆酸钠水溶液于霍乱弧菌混匀制成浓厚菌液 1min内悬液由混变清 并变得粘稠 以接种环挑取时可以拉出丝来 霍乱弧菌古典生物型和ElTor生物型均呈阳性 霍乱红试验 出现蔷薇色 为霍乱红试验阳性 由于霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应 故无特异性 霍乱弧菌含
11、有色氨酸酶 能分解色氨酸产生吲哚 霍乱弧菌液能还原硝酸盐为亚硝酸盐 因此当霍乱弧菌培养在含有硝酸盐成分的蛋白胨水中 所产生的亚硝酸盐可与吲哚结合成亚硝酸吲哚 滴加浓硫酸即可出现蔷薇色 称为霍乱红试验阳性 O 129敏感试验 将O 129 2 4二氨基 6 7 二异丙基喋啶 药敏纸片 10 150 g 贴在接种有待测菌的琼脂平板上作纸片扩散试验 凡药物纸片周围出现抑菌环者为敏感 4 霍乱弧菌的分型鉴别试验 血清分型 用小川型和稻叶型单价诊断血清作玻片凝集 与小川型血清凝集而与稻叶型血清不凝集者为小川型 反之为稻叶型 在两个单价血清中均有明显凝集者为彦岛型 生物型别的鉴定 目前 两型主要依靠第 组
12、霍乱噬菌体裂解试验进行鉴别 并辅以多粘菌素敏感试验 鸡红细胞凝集试验 V P试验和溶血试验 第 组霍乱噬菌体裂解试验 第 组霍乱噬菌体常规稀释液 106 ml 一般仅裂解古典型 而不裂解ElTor型 多粘菌素B敏感试验 取被检菌2 3h肉汤培养物点种到含药营养琼脂平板上 多粘菌素B50U ml 37 培养24h ElTor生物型生长 而古典型敏感 鸡红细胞凝集试验 在玻片上滴加生理盐水一滴 取被检菌18 24h培养物少许在盐水中制成浓厚菌悬液 然后加一滴2 5 鸡红细胞悬液 充分混匀 1min内出现凝集者为阳性 红细胞呈均匀分散者为阴性 ElTor生物型为阳性 古典型为阴性 鉴定要点 确诊O1
13、群霍乱弧菌必须具备的条件 1 涂片为革兰氏阴性弧菌或杆菌 2 TCBS等选择培养基上典型的菌落特征 3 动力阳性 4 O1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性 四 防治原则 必须贯彻预防为主 人群的菌苗预防接种 可获良好效果 治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药物如四环素 链霉素 氯霉素 强力霉素及氟哌酸类抗生素药物 第二部分弯曲菌属 弯曲菌属 Campylobacter 细菌是一类微需氧 不分解糖类 氧化酶阳性 菌体弯曲呈逗点状 S型或螺旋状 有动力的革兰氏阴性菌 对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种 前者是人类腹泻最常见的病原菌之一 后者在免疫功能低下时可引起败血症 脑膜炎等
14、本节主要以空肠弯曲菌介绍本属的生物学特性和检验方法 一 生物学性状 一 形态与染色空肠弯曲菌 C jejuni 菌体轻度弯曲似逗点状 长1 5 5 m 宽0 2 0 8 m 菌体一端或两端有鞭毛 运动活泼 在暗视野镜下观察似飞蝇 有荚膜 不形成芽胞 革兰氏阴性 图注 空肠弯曲菌的两端单鞭毛 负染 21000 二 培养特性为微需氧菌 在含2 5 5 氧和10 CO2的环境中生长最好 最适温度为37 42 在正常大气或无氧环境中均不能生长 本菌营养要求高 需加入血液 血清才能生长 在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落 单个菌落呈中心凸起 周边不规则 无溶血现象 三 生
15、化反应空肠弯曲生化反应不活泼 不发酵糖类 不分解尿素 不液化明胶 靛基质阴性 可还原硝酸盐 氧化酶和过氧化氢酶为阳性 甲基红和VP试验阴性 枸椽酸盐培养基中不生长 四 抵抗力抵抗力不强 易被干燥 直射日光及弱消毒剂所杀灭 56 5分钟可被杀死 对红霉素 新霉素 庆大霉素 四环素 氯霉素 卡那霉素等抗生素敏感 但近年发现了不少耐药菌株 五 抗原构造本菌抗原构造与肠道杆菌一样具有O H和K抗原 根据O抗原 可把空肠弯曲菌分成45个以上血清型 二 致病性与免疫性 空肠弯曲菌是多种动物如牛 羊 狗及禽类的正常寄居菌 污染食物和饮水 可引起人类急性肠炎和食物中毒 其致病因素与肠毒素 内毒素 细胞毒素 侵
16、袭力有关 感染后能产生特异性血清抗体 三 微生物学诊断 一 标本采集 取腹泻病人新鲜粪便或肛拭子立即送检 如不能及时送检 应将标本接种于卡 布运送培养基 二 检验程序 三 检验方法及鉴定1 直接涂片 1 悬滴标本检查 显微镜下观察有无投镖式或螺旋状运动的细菌 脑脊液制成涂片作悬滴检查 2 革兰氏染色检查 为革兰氏阴性 逗点状 S形或螺旋状小杆菌 2 分离培养 选择培养基分离接种于具有高度选择性的平板培养 布氏菌血琼脂抗性分离培养基 然后放玻璃缸内 内含85 N2 10 CO2 5 O2 置42 孵箱内培养48小时 挑选可疑菌落 菌落为灰色 平坦 规则 在血平板上不溶血 再用生化反应和血清凝集试验作出最后鉴定 鉴定要点 氧化酶阳性 革兰氏阴性 菌体弯曲或称S形 微需氧 触酶试验阳性 不利用糖类 42 时生长 空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌的生化反应鉴定 四 防治原则 本病的预防在及时诊断和治疗病人 以免传播 加强卫生防疫及人畜粪便管理 注意饮食和饮水卫生 本菌对多种抗生素敏感 常用红霉素 四环素 庆大霉素治疗 谢谢
