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1、前 言 近年来,随着石油、天然气的日渐枯竭，传统煤炭发电体系造成污染的日益严重，太阳能、海洋能和生物能等可再生能源正日益受到了政府和科学家们的极大重视，作为可再生能源开发的主角，微生物在能源可持续开发中发挥了重要作用。而微生物燃料电池(microbial fuel cell，MFC)的出现，便是最好的例证。但不可否认的是，由于技术条件的制约， 目前生物燃料电池的研究和使用还处于不成熟阶段：电池的输出功率小、使用寿命短，且阴极使用的电导液也存在腐蚀电极，污染环境等问题。为此，各国研究人员对微生物电池进行了深入研究。2005年，来自美国俄亥俄州大学的科学家首先提出了使用牛瘤胃胃液中的微生物作为发电
2、原料。随后，西班牙皇家化学学会也进行了相关的研究，并在他们公布的一项研究报告宣称，牛胃液中所含的细菌群在分解植物纤维的过程中能够产生电力，电能约与一节5号电池相当。虽然通过这种方式获得的电能比较小，但是就现在的研究来看，牛很有可能在将来的某一天成为便宜电能的来源，为能源匮乏的人类社会带来巨大效益。如今，许多研究集中在MFC装置设计改进上以获得较大的功率输出，然而对MFC微生物产电能力和代谢过程电子向电极传递的机制的认识，有助于弄清生物学电子传递物质与电极间的相互作用和相容性，这是设计优良性能MFC系统和电极材料的基础。MFC中微生物学研究重点是找到那些能直接将电子传递给阳极的细菌，这类细菌被称
3、之为产电细菌(electricigens)，即能够在厌氧条件下完全氧化有机物成CO2，然后把氧化过程中产生的电子通过电子传递链传递到电极上产生电流，同时自身在电子传递过程中获得能量支持生长的菌类。目前，本课题组通过富集筛选和人工驯化，已成功获得纤维素降解菌群和产甲烷气菌群，在自主设计的200ml双室微生物产电模型中，以羧甲基纤维素、麸皮、干草等为发电底物时，输出电压平均为0.9V，产电周期超过180小时。尽管课题组已取得部分成绩，但距离电池的推广和实际应用还有较大距离，因此还需进一步研究。 据此，本研究在继承前期成果的基础上，拟以进化完善的瘤胃微生物共生体系为研究对象，在已筛选出的生理上相互依
4、赖的纤维素降解菌群和产甲烷菌群的基础上，进行纤维素降解菌群和产甲烷菌群的16S rRNA生物学鉴定，确定其基因背景和亲缘关系，以便更采用分子生物学技术提高菌种产电能力，为进一步开发高效无毒的生物电极提供理论数据。第一章 文献综述1.1 瘤胃微生物双室电池的研究现状微生物电池(Microbial fuel cell，MFC)是以微生物作为反应主体，利用微生物的代谢产物作为物理电极的活性物质，产生电位差，获得电能的装置。不仅无污染、效率高、反应条件温和，而且燃料来源广泛，因此微生物发电已成为了各国争相研究的课题。2005年，来自美国俄亥俄州大学的科学家首先提出了使用牛瘤胃胃液中的微生物作为发电原料
5、。随后，西班牙皇家化学学会也进行了相关的研究，并在他们公布的一项研究报告宣称，牛胃液中所含的细菌群在分解植物纤维的过程中能够产生电力，电能约与一节5号电池相当。一年前，本课题组采用焦性没食子酸厌氧培养法从牛瘤胃液中,分离纯化出纤维素分解菌和产甲烷菌。并初步探讨了这两种菌株的基本生长情况：如生长曲线，葡萄糖生成情况，电导率变化情况等。对于微生物燃料电池的研究则是，先以纤维素分解菌和不同导电溶液进行微生物燃料电池的产电研究。发现以铜锌为阴阳电极（电极尺寸50mm*10mm），以0.5mol/L硫酸铜溶液作为阴极溶液，以分解纤维素菌株发酵液作为阳极溶液，以鱼鳔作为离子交换膜的电池，200mL纤维素分
6、解菌株发酵液最多能产生1.03V的输出电压和1.2V的电池电位差。以纤维素分解菌和产甲烷菌进行微生物燃料电池的产电研究。在相同产电条件下， 200mL纤维素分解菌株发酵液最多能产生1.04V的输出电压和1.08V的电池电位差。两种菌发酵液的电池，产电效果良好且可持续产电180小时。但是，初步成果的背后隐藏着诸多问题，如铜芯电极的腐蚀，生物膜不能长时间使用等，另外，电池的输出电压还有待提高，产电时间也需进一步延长，以达到实际应用水平。因此，本课题组又对微生物电池进行了进一步的探索，首先是对阴极电解液多样性的研究。以铜锌为阴阳电极（电极尺寸50mm*10mm），以0.5mol/L高锰酸钾溶液作为阴
7、极溶液，以分解纤维素菌株发酵液作为阳极溶液，以鱼鳔作为离子交换膜的电池，200mL纤维素分解菌株发酵液最多能产生1.39V的输出电压和1.46V的电池电位差，产电时间维持在180小时左右。以铜锌为阴阳电极（电极尺寸50mm*10mm），以0.5mol/L铁氰化钾溶液作为阴极溶液，以分解纤维素菌株发酵液作为阳极溶液，以鱼鳔作为离子交换膜的电池，200mL纤维素分解菌株发酵液最多能产生1.28V的输出电压和1.36V的电池电位差，产电时间维持在180小时左右。其次，本课题组又采用萘酚膜代替鱼鳔进行了相同实验，以0.5mol/L高锰酸钾溶液作为阴极溶液，结果显示电池电位差和输出电压分别比用鱼鳔提高了
8、16.6%和18.1%，达到1.62V和1.73V；以0.5mol/L铁氰化钾溶液作为阴极溶液，结果显示电池电位差和输出电压分别比用鱼鳔提高了14.2%和15.1%，达到1.46V和1.57V。随后，课题组又对电极进行了一些研究，采用碳膜代替铜锌电极，以期消除其腐蚀因素，结果显示，无论是双菌产电，还是单菌产电，其输出电压和电池电位差较铜锌电极相去甚远，无法满足发电要求，因此还需进一步探索。众所周知，瘤胃微生物生长要求复杂的营养因子和严格的厌氧环境，而且某些细菌的共生依赖性非常强，这使得瘤胃细菌难以在体外进行分离培养，显微镜直接观察计数和分离培养比较的结果表明，在体外培养成活的细菌仅占瘤胃总细菌
9、数的10 (Bryant等，1953)。因此，若能获得完整的瘤胃细菌生态系统组成，进而更加深入地研究瘤胃发酵的机理，然后从发酵的机理入手，设计出更加适合的电解液，才是提高微生物电池产电功率的关键。因此，本文拟从已培养出的瘤胃微生物入手，运用16s rDNA技术对其进行种群分析，从而为微生物燃料电池的研制提供理论基础。1.2 分子生物学技术在瘤胃微生物群落结构分析中的应用传统的微生物分析测定技术，如显微镜观察、选择性培养基计数、纯种分离等技术，由于方法本身的局限性，很难真实准确地反映出瘤胃微生物中细菌的种类和数量。同时，对于瘤胃样品的培养分离，周期较长、工作量大，且培养基的选择性对微生物原有种群
10、结构会有影响和破坏。分子生物学方法与传统的分离培养方法相比，在研究微生物群落结构组成时，有很大的优越性。分子生物学技术是以微生物的核酸(基因组DNA或RNA)序列为依据，通过分析瘤胃样品中核酸分子的种类和数量来反映其微生物群落结构中各种群的种类和数量网。由于每种微生物细胞都具有独特的核酸分子，其序列组成也有各自独特的特征，因此，通过直接从瘤胃样品中提取所有微生物的核酸(基因组总DNA或RNA)，依据核酸序列的不同，分析这些DNA或RNA的种类和相对数量，就可以反映出微生物的种类组成以及种群数量的比例情况，从而对微生物的群落结构得到一个比较全面、客观的认识。近年来，分子生物学技术在微生物群落结构
11、分析中的应用主要包括:(1)克隆文库分析在分析瘤胃样品中核酸分子的种类和数量时，由于直接提取的核酸分子的量很少，不能用于直接分析，一般是通过PCR扩增和构建克隆文库的方法。即先从环境样品中提取出微生物基因组总DNA，然后用携带了物种进化信息的标记基因(常用的是核糖体RNA基因)的通用引物或种属特异性引物对微生物基因组总DNA进行PCR扩增。PCR扩增产物与载体连接后，转化大肠杆菌，得到大量的转化子。这些转化子就组成了一个克隆文库，每个转化子都含有一个标记基因的序列。通过对文库各转化子序列的测定，就可以知道该瘤胃样品中这些基因的种类和相对数量，从而获得群落组成的信息。(2)探针杂交技术每一种微生
12、物都具有与其他微生物不同的、独特的核酸片段，通过分离和鉴定这些片段就可制备出核酸探针。单链DNA探针在与其互补的RNA或DNA相遇时，两者的互补片段在一定条件下能退火形成氢键，形成稳定的双链结构，此即为核酸杂交。根据这个原理，以一条特异标记(荧光、同位素或DIG等)的核酸片段为探针，就可以检测出另一条靶核酸序列的存在。该技术在微生物群落结构研究中起了重大作用。如荧光原位杂交 (fluorescent in situ hybridization，FISH)技术、基因芯片 (microarray)技术等。(3)遗传指纹图谱分析该方法是将代表微生物群落结构的核酸分子进行各种形式的凝胶电泳，从而将代表
13、微生物群落中的各种不同种群的核酸分子分开。凝胶电泳中各微生物群落核酸分子的迁移行为就构成了该群落特异的指纹图谱。该方法的一大优点是可以同时对比大量的微生物群落样品。如核糖体DNA扩增片段的限制性内切酶分析 (amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)、变性/温度梯度凝胶电泳分析(denatured/temperature gradient gel electrophoresis, DGGE/TGGE)、单链构象多态性分析 (single strand conformational polymorphism，SSCP)、末端限制性片段长
14、度多态性分析 (terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、核糖体基因间隔序列分析 (ribosomal intergenics spacer analysis，RlSA)、随机扩增多态性DNA分析 (random amplified polymorphic DNA，RAPD)、磷脂脂肪酸图谱分析 (phospholipid fatty acid，PLEA)等技术都被广泛应用于微生物群落结构的分析。1.3 16S rDNA生物分类学鉴定机理 细菌体内普遍存在3种核糖体rRNA，即23、5和16S rRNA，它们与核糖体大小
15、亚基组合在一起共同参与细菌的蛋白质合成过程。其中16S rRNA大约2.9 kb，比真核生物的相应rRNA略小。随着对细菌研究的不断深人，人们发现，16S rRNA及其基因在细菌种系发生与鉴定方面有着无可比拟的优势与作用。1.3.1 16S rRNA在细菌种系发生和分类学上的应用16S rRNA具有功能上的高度稳定性，各种细菌都有16S rRNA。在不同细菌不同位点上，16S rRNA基因的变异频率不同。16S rRNA相对分子质量较大，并且含有许多结构域，其二级结构中可有高达50个螺旋管结构，几乎是23S rRNA的2倍，所包含可供区别的信息极为丰富。另外，基于具有部分互补区的不同DNA片段
16、之间在一定条件下可以形成异源复合体，在复合体中，非互补区将形成一定的扭曲结构，分散在形成互补的双链之间，电泳过程中可因为构象不同引起迁移率的差异，从而也能对具有不同远近亲缘关系的细菌加以区分，这样就可以不需做序列分析。据研究结果显示：16S rRNA基因同源性即使在80一100的细菌都可以用该法加以区分，仅仅需要纳克级的DNA就能满足分析要求，特别适用于不容易或者不能培养的细菌的起源和分类学研究。在以16S rRNA为进化分类标准以前，人们不仅对细菌的种系发生关系知之甚少，甚至所知范围内的知识也包含许多误解。传统上常常采用依据细胞壁结构的不同把细菌分成革兰阳性和革兰阴性菌，但是实际上革兰阳性菌从种系发生角度看尚可看成是互有关联的一群细菌，而革兰阴性菌则至少包括10种极为不同的群体。通常支原体也常常被划分为远离一般细菌的范畴，而实际上真正的支原体仅仅是退化了的芽胞梭菌属细菌。从
