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1、0 引言 发展现代农业，走生态农业之路，是实现社会主义新农村建设的必经之路，是发展农村生产力和实现农村经济快速健康发展的迫切需要。然而，目前农村的实际情况是以农作物秸杆为主的大部分天然纤维素一部分是自然腐烂，还有一部分是被农民焚烧。这不仅污染环境，而且造成了自然资源的极大浪费。因此，如何将纤维素物质降解转化为糖、乙醇、甲烷等容易利用的小分子有机物是当前国际上的重大课题之一。目前,高温好氧堆肥化处理是解决农村固体废物问题的一个重要途径,具有保护环境,节约原材料和能源、投资少、运行费用低等优点1 。但是,农村固体废物,尤其是农作物秸秆中含有大量的木质纤维素,其成分复杂,难以被充分利用或被大多数微生
2、物直接作为碳源物质而转化利用2 。因此,木质纤维素的生物降解成为生物技术处理有机固体废物的关键,也是近年来研究的重点。然而,在木质素、纤维素和半纤维素等分子产生破坏,断裂和分解的主要阶段堆肥高温阶段,由于温度的影响,微生物种群受到很大的抑制,表现为种类单一,数量减少,比中温阶段要少12个数量级,这无疑限制了大分子难降解的木质纤维素物质的快速降解3 。已有的研究表明4 ,在堆肥高温阶段,堆肥中绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死,是保证堆肥无害化的最重要阶段。但同时堆体温度不宜过高,否则不仅抑制大部分微生物的生长和活性,并且会过度消耗有机质,降低堆肥产品质量。堆体温度应控制在4565 之
3、间,尤其是在5560 时比较好,此时也是木质纤维素等大分子物质降解的最适温度6,因此,研究该温度范围内的微生物活性及降解性能具有重要意义。在高温纤维素分解菌的筛选及性状研究方面,国内外均有相关报道,种类从真菌,放线菌到细菌均有所涉及。Peter L. Bergquist 等6曾经列举总结过一系列的高温木质纤维素分解菌,他们大部分都是厌氧菌,其中只有3 种是好氧菌。韩如等7 利用纤维素降解细菌和纤维素粘附的方法分别从新鲜牛粪、高温堆肥和实验室保存的纤维素降解富集物中分离得到4 株嗜热厌氧纤维素降解细菌。分离菌株能利用纤维素滤纸、纤维素粉、WhatmanCFII、微晶纤维素、纤维素粉MN300 和
4、未经处理的玉米秆芯、甘蔗渣、水稻秸秆等。林世平等8 在从温泉、油井等热源地区采集的大量样品中,经过反复的富集、筛选,获得了多株特殊的高温厌氧纤维素分解菌。这些菌株都能在5070较好地生长,且具有明显高于中温菌的活力。张毅等9从贡嘎山热温泉及土壤堆肥中分离到四株嗜热厌氧纤维素分解细菌,能直接转化纤维素产生酒精。齐云等10从堆肥中分离出一株分解纤维素的高温耐碱菌株,该菌株在固体纤维素平板上,培养4d可产生明显的分解纤维素透明圈。除此以外还有一些其他相关报道1115 。但以上研究的研究对象多偏重于厌氧高温纤维素分解菌,好氧高温纤维素分解菌涉及较少;研究内容多偏重于分类学方面以及菌株在厌氧发酵纤维素类
5、物质方面的应用。近年来一些国内学者16 也曾经研究了一个复合产纤维素酶的体系,得到一组分解能力很强的混合体系并已经制成复合菌剂用于复混肥的生产,该方面的研究也正在逐步展开。本研究通过从堆肥、温泉等中采集样品筛选分离,获得若干生长快,耐温性好,降解性能强的高温好氧菌株, 可以为农村纤维素固体废物高温好氧微生物菌处理提供一定的理论依据。1 材料与方法 1.1 材料 从温泉（弥勒、腾冲）、碧色寨堆肥采集样品。1.2 滤纸处理 滤纸用1%醋酸浸泡24h, 用碘液检验确定无淀粉后。再用2%NaHCO3洗至中性,晒干待用。1.3 仪器及试剂1.3.1 主要仪器: SW-CJ-IF洁净工作台（苏州泰安空气技
6、术有限公司）、THz-031高精度恒温振荡摇（上海申能博采生物科技有限公司）、MJP-250型霉菌培养箱（上海精密实验设备有限公司）、电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）、RHB-KT/C加热磁力搅拌器、旋涡混匀器、AKUP-III-20纯水器（台湾振大水处理器材（太仓）有限公司）。1.3.2 试剂配制：1)醋酸缓冲液(pH5.2)：取10.52g冰醋酸钠溶于450ml蒸馏水中，用冰醋酸将该溶液的DH值调至5.2(约用l2 mI)，用蒸馏水定容至500ml17。2）DNS试剂 ：称取酒石酸钾钠91 g于500ml蒸馏水中，依次加人3、5一二硝基水杨酸3.5 g，NaOH 20 g，加热
7、搅拌，使之溶解，再加人重蒸酚2 g，无水亚硫酸钠2 5 g，搅拌使之溶解，1000ml定容，贮于棕色瓶中，冰箱低温保藏1周后使用。3) CMC溶液：称取10gCMC(羧甲基纤维素钠)溶于1000mL醋酸缓冲液(pH5.2)，加热使之溶解，保存于冰箱中，以待使用。4）葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110烘箱中烘2 h至恒重，称取0.1080 g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100 mL。5）刚果红染液（1%）：称取刚果红1g，溶于100mL蒸馏水，振荡静置，待之溶解完成后，用细菌过滤器灭菌待用。1.4 培养基1.4.1 初选培养基NaNO3 0. 5 g, KCl 0. 5 g, K2HPO4
8、1. 0 g, Fe2 ( SO4 ) 37H2O (痕量) , CaCl2 (痕量) ,CuSO4 (痕量) ,MgSO47H2O 0. 5 g, 蒸馏水1 000 mL, pH值7. 5,以滤纸作为唯一碳源，温度 121 灭菌 30min。1.4.2 分离培养基PDA培养基(马铃薯200 g, 蔗糖20 g, 琼脂16 g, 水1 000mL) 。温度 121 灭菌 30min。1.4.3 CMC培养基CMC-Na 10 g, (NH4 ) 2 SO4 4 g, KH2 PO4 2 g, MgSO47H2O 0. 5 g,蛋白胨1 g,琼脂16 g, 蒸馏水1 000mL。温度121灭菌3
9、0min。灭菌后，先用刚果红染液染色，再用于培养。1.5 实验方法1.5.1 高温纤维素分解菌的筛选,分离及纯化 采集样品经过稀释，接入初选液体培养基中，在55恒温振荡摇床上，60r/min的条件下培养7d后观察，依据滤纸崩解的程度，从而初步筛选出高温纤维素分解菌液。将筛选出的菌液按逐级稀释法稀释,取稀释度为1010的悬浊液50L 接种到平板分离培养基内，用推棒涂布均匀，再放入恒温箱，在55下培养7d后观察菌落形态特征。观察平板分离培养基中的菌落后，用接种针挑取菌落，接入到60mL的富集培养基中进行扩大培养23d（每个菌落富集一次）。然后，将扩大培养的菌种取100L接到刚果红CMC培养基上，摊
10、平，55培养于恒温培养箱中，7d后观察有无透明圈，并将有透明圈的菌落进行保存，便于进一步的研究。1.5.1 对滤纸的分解效果测定 将各菌株接种到以滤纸为唯一碳源的液体培养基中, 55,在转速为60r /min的摇床培养5 d, 观察滤纸的崩解效果, 以“ + ”的多少来表示滤纸崩溃程度, “ + ”越多,说明该菌株的降解效果越强18。1.5.3 高温纤维素分解菌的碳源谱的测定分别以葡萄糖、蔗糖、半乳糖、D-甘露糖、山梨醇、淀粉6种糖作为碳源用初选培养基对各菌株进行培养23d，采用分光光度法测定各菌液的吸光度。因为当一束平行的单色光通过均匀的、非散射的吸光物质时，其吸光度与溶液厚度和浓度乘积成正
11、比，即A=kbc19，其中A为吸光度；k为一个常数；b为溶液厚度；c溶液浓度。糖的利用率与菌的生长浓度呈正相关，因此，在没有外界条件干预的情况下，糖的利用率与细菌的吸光度也呈正相关。1.5.4 菌株生长特性与温度稳定性测定 将获得菌株在富集培养基上活化后，用接种针挑取少量的菌液分别接种于10mL,以葡萄糖为碳源的初选液体培养基中，并分别置于40、45、50、55、60下，120rpm振荡培养23d，采用分光光度计法在600nm波长下测定其吸光度，进而检测其菌液密度，从而研究其温度稳定性及生长特征曲线。1.5.5 菌株的酶活力测定原理：根据纤维索酶在适宜的条件下能够水解CMC和纤维素分子，并且释
12、放出还原糖的特性，在一定条件下，定量测定还原糖的含量，从而测出其酶活。3，5-二硝基水杨酸在碱性条件下，与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520 nm处的吸光度，得出还原糖的量20。将分离到的菌株分别接种1mL到装有200ml液体培养基的三角瓶中，振荡培养6d将培养液于4、4000r/min离心15min取上清液作为粗酶液，测其对CMC酶活力、纤维素酶活力21。 1.5.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制取7支10 ml试管分别加入10 gml的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml。补加蒸
13、馏水至2 ml，加入定量的DNS试剂。沸水浴显色后定容，在适宜的波长条件下测吸光值A，以A为横坐标，葡萄糖含量为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。1.5.5.2 羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活测定25 ml具塞试管中加入1.5 m1以0.2 mo1 pH值为5.2 HAc-NaAc缓冲液配制的1 CMC溶液，置于不同温度的水浴中热5 min 。加0.5 m1适当的粗酶液，不同温度准确反应30 min加入DNS试剂沸水浴显色后定容至25 ml摇匀。以相同条件下沸水浴灭活5 min的酶液为空白在适宜的波长条件下测定吸光值然后在相应的葡萄糖标准曲线上求得生成的葡萄糖的量。 酶活力（u/ml）= 其中5
14、为保温时间（酶与底物作用时间，min）; Ew为粗酶液的体积（ml）; u是在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1mol葡萄糖的酶量22。1.5.5.3 滤纸酶(FPA)活力测定 将滤纸(1cm6cm)卷成小卷放进试管内，加入1.5ml乙酸0乙酸钠缓冲液(PH值为4.8)，再加入0.5ml 酶液，轻轻摇匀，使滤纸完全浸泡在液体中，在不同的温度下，保温5min；加入DNS试剂，沸水浴显色后定容至25 ml摇匀。以相同条件下沸水浴灭活5 min的酶液为空白在适宜的波长条件下测定吸光值。然后在相应的葡萄糖标准曲线上求得生成的葡萄糖的量。酶活力（u/ml）= 其中5为保温时间（酶与底物作用时间，min
15、）；Ew为粗酶液的体积（ml）; u是在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1mol葡萄糖的酶量。2 结果与分析2.1 高温纤维素分解菌筛选、分离及纯化的结果 从猪粪、牛粪、羊粪等材料中分离得到6株能够在55生长，并在刚果红CMC培养基上形成清亮透明圈的高温好氧细菌，在文中标记为TCM（thermophilic cellulolytic microorganism）。它们在刚果红CMC培养基上的菌落形态特征如表1所示。表1 高温纤维素分解菌在CMC固体培养基上的菌落形态特征菌株颜色和形态表面特征滤纸崩解度溶菌圈TCM-1黄色透明，不规则凸起粗糙+有TCM-2黄色有白膜，圆形凸起湿润光滑+有TCM-3最外圈白色，中间淡黄色，圆形中间光滑透明+有TCM-4微黄色，圆形。呈放射状光滑干燥+有TCM-5淡黄色，约呈圆形。粗糙湿润+有TCM-6黄色呈直条状粗糙干燥+有+滤纸断裂,振摇成均匀糊状；+滤纸断裂,振摇成有碎片糊状；+滤纸断裂,振摇不成糊状23。2.2 高温纤维素分解菌的碳源测定结果
