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1、黑麂类MHC DQA基因第二外显子扩增及序列分析院摘 要：主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)基因在机体对病原体免疫方面的联系已经得到越来越多的理论支持，特别是其类的DQ, DR基因，其多态性水平在一定程度上衡量着种群的进化潜力。作为一种功能基因遗传标记，其在非模式物种自然种群中的运用越来越多。黑麂(Muntiacus crinifrons)为中国特有的濒危鹿科动物，其野生种群分布范围和数量正逐步缩小。本文扩增了51个黑麂样品的MHC-DQA 第二外显子部分序列，结果得到3个等位基因，彼此之间的核苷酸差异从7到20个（氨基酸差异从4到
2、14个）。没有一个个体获得两个以上等位基因，这说明这些序列可能来自单座位。 抗原结合位点(antigen-binding site ABS）上的非同义替代（dN=0.1560.059）显著大于其同义替代率(dS=0.0120.011)，这暗示着DQA基因曾遭受正选择作用。关键词：黑麂；鹿科；MHC； DQA； 序列分析The Study of MHC DQA exon 2 amplification and sequence analysis in the Muntiacus crinifronsCuilan Hou, College of life scienceAbstract: The
3、major histocompatibility complex (MHC) has gained the more and more theoretical evidences of the relevance in pathogen resistance. Particularly the DQ, DR genes, which the level of polymorphism indicated the potential evolutionary ability to some extent. As a genetic marker of functional gene, it us
4、ed a lot in non-model species in natural populations. The distribution of the wild populations of Black Muntjac (Muntiacus crinifrons), an endangered species endemic to China, is very narrow and its number is decreasing. In this study, we amplified partial MHC class II DQA exon 2 sequences from M. c
5、rinifrons. As a result, three alleles were detected in 51 investigated samples, which differ from each other by sever to 20 nucleotide substitutions (four to 14 amino acid substitutions). No a single individual obtained more than two alleles, which suggests these sequences may be from a single locus
6、. A significantly higher rate of non-synonymouse substitutions (dN=01560.059) than synonymous substitutions (dS=0.0120.011) in antigen-binding site (ABS) codons indicated positive selection in the DQA locus.Key words: Muntiacus crinifrons； Cervidae； MHC ； DQA；sequence analysis1. 引 言:黑麂(Muntiacus cri
7、nifrons),属偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)麂属(Muntiacus)，为我国特有动物，是典型的亚热带山地森林动物。在我国被列为国家一级保护动物，在濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)和国际自然与自然资源保护联盟(IUCN)名录中分别被列入附录和易危(VU)级，被公认为目前世界上最珍稀的鹿科动物之一。黑麂现仅分布于皖南、浙西以及与之接壤的江西和福建的局部山区，野生种群数量十分稀少（盛和林，1987）。利用中性分子标记对该物种野生3个种群的遗传结构分析结果发现，历史上，黑麂种群经历了明显的瓶颈效应，遂昌种群与黄山以及天目山种群之间已经发生了显著的遗传分化
8、，种群间的基因流受阻（Wu et al., 2006, 2007）。合肥野生动物园内的黑麂圈养种群始于1987年，1989年获得圈养条件下的成功繁殖，种群数量最多时近50头（包括从该园向其它地区的输出个体），遗传分析结果表明，该种群遗传多样性远远低于野生种群，建群个体对后代的遗传贡献存在很大差异，等位基因频率出现严重偏移(WuFang, 2005；Ni et al, 2009)。近年来该圈养种群受多种疾病困扰，数量明显下降，出现了明显的衰退迹象。 主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC)是脊椎动物体内与免疫应答密切相关的一类多基因家族
9、（Klein 1986）。MHC类分子负责监视细胞外环境，主要向 CD 4 + T 细胞提呈外源性抗原（Germain and Margulies, 1993）。其中由第二外显子编码的特别是抗原结合位点（ABS），往往因其直接参与呈递抗原而被赋予一定的选择优势从而表现出高度的多态性（Racioppi et al.,1991；Apaniuset al. 1997; Hedrick and Kim 2000; Hughes and Yeager 1998）。通常认为，MHC基因多态性越高，机体抵御病原体和寄生虫感染的能力就愈强，因此，MHC基因的高度多态性，赋予脊椎动物应对复杂内外环境的进化潜力（
10、PottsSlev 1995）。相比中性分子标记，保护遗传学家对MHC的研究结果更为关注，特别是其可能与个体适合度、种群存活力等重要的生物学属性密切相关，只有通过研究受自然选择作用的遗传变异才能真正理解目标物种的适应进化过程（Hedrick 2001）。这并不意味着MHC基因可以替代中性标记，但越来越多的学者认为MHC基因是迄今阐述脊椎动物适应性进化的最佳候选标记（Sommer, 2005）。目前，对MHC的研究又大多集中在普遍具有多态性的DRB基因上，对DQA的研究相对较少，且多半是关于模式动物或经济效应高的物种。目前研究的比较透彻的是牛和羊的DQA，共检测出3个牛的DQA座位和2个羊的DQ
11、A座位，且都有很高的多态性(Andersson and Rask, 1988；Scott et al.；1991)。而关于黑麂的MHC甚至麂亚科的MHC报道都为零，由于评定种群遗传多样性水平对物种保护策略制定的重要性。 本文利用PCR-SSCP、克隆及测序技术，分析了野生种群及圈养的共51个黑麂样品的MHC类DQA第二外显子部分序列，同时也望为研究MHC的进化机制提供来自麂亚科的资料。2.材料和方法2.1 实验材料 本文用于检测的黑麂样品共51份，分别采自皖南和浙西山区（39份），采自合肥野生动物园圈养的样品12份，其中包括皮张、血液和肌肉样品。2.2 基因组DNA提取 采用“酚-氯仿法”(S
12、ambrook et al.,2002)，从对黑麂的皮张、血液和肌肉样品提取基因组DNA。2.3 引物设计及PCR扩增两对来自Ballingall et al., 1997，两对自行设计。所有引物信息见Table 1。Table 1. Primers tested in this study引物名引物序列（53）引物来源QA005ATTGTGGC(T,G)GACCAC(G,A)TTGGC Ballingall et al., 1997QA006CACTTACCATTGATAACAGG Ballingall et al.,1997QA007CATACTGTTGGTAGCAGCA Ballinga
13、ll et al., 1997QA010GAGACTTGGAAAACACAGTC Ballingall et al.,1997DQAF1AGGTGGACACTTACCGTTG 自行设计(Ta=56)DQAR1TTGGCTCCTATGGCACAG 自行设计DQAF2CGTTGATAACAGGGGTAAAG自行设计(Ta=55)2.3.1 PCR扩增首先利用引物QA005/QA010（Ta=60）扩增DQA1和DQA2的共享片段，以扩增产物为模板，再用引物对QA005/QA007（Ta=55）和QA005/QA006（Ta=55）分别扩增DQA1和DQA2。反应总体积40l，其中含50-100 n
14、g模板DNA，0.3M引物，2 mM MgCl2 ,0.2 mM dNTP, 10Exbuffer 和 1.5 U ExTaq DNA聚合酶。PCR 反应条件：95 预变性5 min，30 个循环（94变性30 s，适宜的温度下退火30 s，72延伸50 s），所有循环结束后，再72 延伸5 min，8保存。2.3.2 PCR反应体系模板DNA 50-100ng引 物 各0.3MMgCl2 2 mMdNTPs 各0.2 mM10Exbuffer 4lExTaq 1.5 UDdH2O 加至总体系40l2.3.3 PCR反应条件95 5min94 30s60 30s 30个循环72 50s72 5
15、min，8 保存2.4 黑麂DQA基因第二外显子SSCP分型取2.3步骤PCR扩增产物2-3 l，与适量加样缓冲液（(98% formamide, 10 mM EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene-cyanol)）混合，95变性3min转置冰上冷却，加入8%（(37.5:1)）非变性聚丙烯酰胺凝胶（含10%的甘油），在8，300V电压，于0.5TBE中电泳10-15h（Bio-Rad, DcodeTM Universal Mutation Detection System）。电泳结束后，硝酸银染色，用尼康（Nikon）D80单镜头数码相机在自然光下拍照。将代表不同SSCP带型的条带割胶回收。2.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备首先配制40的丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺（37.5:1），过滤后于4保存丙烯酰胺 38.93g 甲叉丙烯酰胺 1.07g dH2O 至 100.0ml 然后按下列配方配制8的聚丙烯酰胺凝胶： 40Acr-Bis(37.5:1) 8ml 10TBE 2ml TEMED 40l 10%
