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1、一、实验前准备清理实验台及仪器。开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15-20 *） 。准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24242mm*） ,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多 ,取材厚度最好不要超过 3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。 ）三、冷冻切片1、取出组织支承器，
2、放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（13 分种） 。2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在 510m 间。4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带 ,可避免组织摊片过程中皱折 ,保证组织结构的完整及切片的美观。注：包埋剂的选用
3、：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂 OCT 剂、B 超藕合剂以及普通胶水。B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或 OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。 （OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。 ）组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约 30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎
4、裂,出现梯田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够 ,切片不易成形或成皱褶。数据图 1 供参考。当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度
5、相同，没有发生上述的现象。四、常用冰冻切片苏木精伊红染色染色步骤：1、冰冻切片用 10%甲醛固定 15 分钟，流水冲洗 2 分钟，蒸馏水浸洗 3 分钟。2、苏木精 12 分钟。自来水快洗。3、0.5% 盐酸乙醇分色 12 秒。蒸馏水快洗。4、0.25%0.5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗 30 秒1 分钟。光镜下检查细胞核分色程度。5、1% 伊红 1 分钟。蒸馏水快洗。6、80% 、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。7、100% 乙醇 2 次，每次 12 分钟。8、二甲苯 2 次，每次 12 分钟。中性树胶封固。注：结束阶段的二甲苯作用为透
6、明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。HE 染色的水洗：整个染色过程中共 5 处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色） ，导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色” 。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。分色后的水洗为自来水
7、快洗，目的是终止分色液（0.5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水） ，为伊红染色提供适宜的染色环境。五、冰冻切片的快速染色法 切片固定 30 秒1 分钟。 水洗(10 秒) 。 染苏木素 35 分钟。自来水冲洗片刻。 （在组织上加苏木精染液数滴,放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干）分化(1%酸乙醇分化 )。 于碱水(氨水) 中返蓝 20 秒。 伊红染色 1020 秒。 脱水，透明，中性树胶封固。 注：固定液的选择A 中性福尔马林溶液 B95%乙醇CAF(40%福尔马林 10
8、ml,95%乙醇 90ml)DCarnoy(纯乙醇 60ml,氯仿 30ml,冰醋酸 10ml)EClzrke 改良液4(纯乙醇 95ml,冰醋酸 5ml)FBouin 液(饱和苦味酸水溶液 75ml,甲醛水溶液 25ml,冰醋酸 5ml)6 种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异,其中 C 固定液固定的切片染色效果最好,组织结构清晰,核染色鲜艳,核无明显肿胀,核浆对比度好,镜下与石蜡切片相似(图 1)。D 液、E 液、F 液染色效果均较好,结构较清晰, 核染色较鲜艳 ,但核有肿胀,核轮廓有些模糊。 A 液染色效果较差,组织结构尚清楚,但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清(图 2)。B 液染色
9、效果差,核着色不良,结构模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸、苦味酸对组织均有固定作用。甲醛对组织的穿透力强,对组织无明显收缩和膨胀作用,但它不能抵消因冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以甲醛固定的组织结构尚完好,核有肿胀、模糊。乙醇对组织有脱水收缩作用,并可沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白,但后者所产生沉淀可溶解于水,使核着色不良。冰醋酸对组织有明显的膨胀作用,加重了冷冻所引起的细胞内液体的膨胀,所以用含有冰醋酸的混合固定液( 如 D 液、E 液、F 液)固定的组织 ,核肿胀明显。F 液中虽然苦味酸对组织有明显的收缩作用,但有冰醋酸的存在仍然防止不了细胞的肿胀。本实验提示混合固定液对冷冻切片 HE 染色的效果优
10、于单纯固定液,但最好使用不含有冰醋酸的混合液。因此,推荐冷冻切片做 HE 染色时首选 AF 固定液。同时,其具有配制简单、使用方便的优点。六、实验后打扫冷冻切片机使用结束后关闭电源,清洁腔体和擦干水气, 做好使用记录。 为让水蒸气蒸发，请不要马上关闭切片机的上盖移门，待过段时间再关。如需详细说明，请借阅说明书。七、主要试剂与溶液的配制1、10% 甲醛甲醛水溶液（3040%）100mL ，蒸馏水 900mL。价格便宜，对标本浸透快，不会产生过硬效果，可作为大标本的保存液，每隔 3 个月更换新液体，但可产生甲醛色素颗粒。2、10% 中性甲醛10%甲醛水溶液 1000mL，过量的碳酸钙（固体）沉积于
11、底部，pH 约为 7.6。可避免其色素颗粒的形成。3、Harris 苏木精苏木精 2.5g，纯乙醇 25mL，硫酸铝钾 50g，蒸馏水 500mL，氧化汞（或碘酸钠）1.25g，冰醋酸20mL。纯乙醇溶解苏木精，然后加入彻底溶解的钾明矾水溶液。分别加入氧化汞和冰醋酸，充分混合即可使用。冰醋酸的加入可以任意选择。4、1% 伊红水溶液伊红 Y10g，蒸馏水 1000mL。混合，加入几粒麝香草酚结晶防止菌类的产生。若组织细胞染色后伊红色度较浅，加入加入 0.5mL 稀释的醋酸水溶液到 1000mL 的伊红溶液内，提高其酸性，增强其色度。染色时间为 15 秒10 分钟。细胞质、其内的嗜酸性物质以及胶原
12、纤维等被染成鲜亮、清晰的红色或粉红色。伊红溶液的最佳染色 pH 为 4.65.0。5、0.5% 盐酸乙醇溶液浓盐酸 0.5mL，70%乙醇 100mL。通常配制 0%盐酸乙醇（70%）储备液备用，需要时稀释即可。6、0.5% 氢氧化铵水溶液25%氢氧化铵 0.5mL，自来水 100mL.由于氨成分易挥发，因此应随时留意溶液中的氨的浓度。石蜡切片的优点在于可以容易的存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止 RNA 降解，保存 一贯很重要。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是切片厚度
13、较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。冰冻切片由于抗原性保存比较好，所以容易出阳性结果，但是组织结构形态的保存没有石蜡切片佳，而且抗原容易弥散，不易观察抗原分布情况。石蜡切片由于处理的原因，抗原常被封闭甚至破坏，需要抗原修复步骤，而且不一定能修复成功。表 1 不同温度下各种新鲜组织用冷冻切片结果组织名称 冷冻头温度 冷冻箱内温度 结果肝肾脾淋巴结心脏- 10 - 12 - 15 - 20 - 15 - 15 - 20 - 25 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕消化管(食道 胃 肠管)- 10 - 15 - 20 - 25 - 15 - 20 - 25 - 30 无法成
14、片成片不理想 ,欠挺真切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕大脑小脑- 15 - 20 - 23 - 30 - 20 - 25 - 28 - 35 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕腺体(唾液腺 乳腺甲状腺 前列腺)- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕皮 肤- 15 - 20 - 25 - 30 - 20 - 25 - 30 - 35 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕脂肪组织花生种子- 15 - 25 - 35 - 30 - 20 - 30 - 35 - 40 无法成片成片不理想 ,欠挺直切片挺直 ,完整切片出现水平小裂痕
