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1、ICSDB43湖南省地方标准DB43/T 2020大型溞繁殖试验技术规程Guideline for Reproduction Test of Daphnia magna Straus（送审稿）2020- - 发布2020- - 实施湖南省市场监督管理局发布目次1 范围32 规范性引用文件33 术语和定义33.1 亲溞 Parent Animals33.2 幼溞 Offspring33.3 死亡 Mortality34 试验原理35 试验程序35.1 试验条件35.1.1 仪器设备35.1.2 受试生物45.1.3 试验用水45.1.4 试验溶液45.2 暴露条件45.3 试验设计55.3.1
2、预实验55.3.2 正实验55.3.3 限度试验55.3.4 参比物质实验65.4 培养基更换频率65.5 幼溞65.6 死亡率65.7 分析、测定频率65.8 数据处理66 质量控制6附录A （资料性附录） Elendt M4培养液和M7培养基的制备7I前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准某些内容可能涉及专利。本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省植物保护研究所提出。本标准由湖南省畜牧水产局归口。本标准起草单位：湖南省植物保护研究所。本标准主要起草人：陈昂、刘勇、张德咏、罗杰、蒋桂芳、陈武瑛、熊浩、罗香文。III大型溞繁殖试验技术操作规程1 范围本标准
3、规定了大型溞繁殖试验的试验原理、试验条件、试验程序、试验有效性、结果调查、数据分析等。本标准适用于湖南省大型溞繁殖试验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY 5051 无公害食品 淡水养殖用水水质3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 亲溞 Parent Animals实验开始时用于繁殖的雌溞。3.2 幼溞 Offspring试验期间亲溞所产的溞。3.3 死亡 Mortality溞体不能游动，或轻晃试验容器，15 s内溞的附肢或后腹部也未见活动
4、。4 试验原理试验的根本目的是评价农药对大型溞繁殖的影响。将溞龄小于24 h的非头胎幼溞（亲溞）暴露于一系列不同浓度的供试物溶液中开始试验。试验周期为21 d。记录每只存活亲溞繁殖的存活幼溞数量，于试验结束时，通过供试物处理组的亲溞繁殖量与对照组比较，确定EC及其95%置信限。还应记录存活的亲溞数量和产第一批幼溞的时间。其他参数，如生长情况（体长）和内禀增长率也可以观察记录。5 试验程序5.1 试验条件5.1.1 仪器设备试验容器和其它试验溶液接触的器皿应为全玻璃制品，或由其它化学惰性材料制成。试验容器通常为玻璃烧杯。需要的主要仪器为：a.溶解氧测定仪；b.适当的温度控制设备；c.pH计；d.
5、水质硬度测定仪；e.测定水中总有机碳（TOC）或化学需氧量（COD）的设备；f.光照控制设备以及光度计等。5.1.2 受试生物受试生物为大型溞（Daphnia magna Straus），保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生殖状态，且亲溞所产存活幼溞的平均值60只。试验开始时，试验用溞应是小于24 h的非头胎溞。试验用溞应来源于同一个健康的保种培养，即未表现任何受胁迫现象（如死亡率高，出现雄溞和冬卵，头胎延迟，体色异常等）。日常培养条件（光照、温度、培养液、喂食单位体积的动物数量）应当和试验条件一致，如果试验时溞类培养基与日常使用的培养基不同，试验前最好设置驯养期，一般试验用溞应在试验
6、条件下驯养3周（即一代）以避免新培养基对亲溞产生胁迫作用。5.1.3 试验用水推荐Elendt M4和M7培养基（见附录A）。Elendt M4和M7培养基不能用于含有金属受试物的测试，对于含有金属的供试品，可选择替代培养基，如不含有EDTA的ASTM重组水。试验开始与试验期间，溶解氧浓度应大于3 mg/L。pH在69的范围内。正常情况下，任何一个试验中pH值的变化不应大于1.5个单位。硬度（以CaCO3计）应大于140 mg/L。5.1.4 试验溶液不同浓度的试验溶液一般由储备液稀释而成。储备液最好是将供试品加入到试验用水中配制而成。若使用溶剂或分散剂助溶，其在培养基中的最终浓度应0.1 m
7、g/L。5.2 暴露条件（1）试验周期：21 d。（2）负载：每个容器一只亲溞，容器中培养液体积为50100 ml。尽管允许合并各平行的溶液进行化学分析，有时为了分析测定供试品浓度的需要，需要增加溶液的体积。若所用体积大于100 ml，需要增加溞的喂食量以确保有足够的食物。对于流水式试验，可分成4个平行，每组10只溞放在一个较大的试验容器中，应记录对于试验设计的任何变化。（3）试验生物：a.对于半静态试验，每个供试物浓度处理组及对照组至少10只溞并分开培养。b.对于流水式试验，要求每一浓度40只溞，分成4个平行，每组10只。也可减少试验用溞，但至少20只，且应该以相同数量分成两个或多个平行。若
8、有亲溞死亡，就不能计算试验结束时每只存活亲溞的繁殖量。在这种情况下繁殖量应该以试验开始时存在的每只亲溞所产存活幼溞总数表示。（4）喂食：对于半静态试验，最好每天喂食，至少也应每周3次（即更换溶液时）。推荐食物：小球藻（Chlorella sp.）、羊角月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）和栅藻（Desmodesmus subspicatus）。喂食量以提供每只亲溞的有机碳数量为基础，应在0.10.2 mg C/（溞d）范围内。喂食量在试验期间可保持不变，也可以在初期稍低，随亲溞的生长而逐渐增加，但始终应在推荐的范围内。如果使用替代测定的方法，如藻细胞数量法或
9、光吸收法来计算喂食量，每个实验室都应单独建立碳含量和替代测定方法的指标之间的线形图。线形图至少每年校准一次。应该给大型溞喂食浓缩了的藻液，尽量避免过多的藻培养液浸入试验容器。浓缩藻液可通过离心获得，然后用蒸馏水、去离子水或溞培养液使其重新悬浮。（5）光照：每天光照16 h，光照强度不超过1500 lx。（6）温度：试验液的温度在1822范围内。对于同一个试验，温度变化不得超过2。（7）曝气：试验期间不能曝气。5.3 试验设计5.3.1 预实验按正式试验的条件，设置较大范围浓度系列的试验药液，每个试验浓度组设2个平行，对照组不设平行，以得到正式试验的浓度范围。5.3.2 正实验在预实验确定的浓度
10、范围内按一定比例间距（极差应控制在3.2倍以内）设置至少5个浓度组，并设立空白对照组，如使用溶剂助溶还应设溶剂对照组。5.3.3 限度试验设置上限浓度10 mg/L，浓度组和对照组均设10个平行。若供试物溶解度小于10 mg/L，则采用最大溶解度作为上限浓度。5.3.4 参比物质实验应定期（至少每年一次）进行参比物质试验，参比物质为重铬酸钾。5.4 培养基更换频率半静态试验中，每周至少更换3次溶液，若供试品不稳定，应考虑增加更换频率，或使用流水式系统。转移亲溞时，原有溶液体积应尽可能最少。5.5 幼溞从头胎开始，应每天从试验容器中移出幼溞，以避免食物的消耗影响亲溞。对存活的幼溞、死亡的幼溞和死
11、胎进行计数，并记录雄溞和冬卵出现的情况。5.6 死亡率每天记录亲溞的死亡数。5.7 分析、测定频率每周测定一次对照组和供试物最高浓度处理组的新、旧溶液的溶解氧浓度、温度、硬度和pH。试验期间应每周测定溶液中的供试物浓度。半静态试验的供试物浓度应保持在配制浓度或初始浓度的20%范围内，那么在更换溶液时，每周测定一次最高和最低浓度组的新、旧溶液的浓度。不在此范围内，则必须分析所有新、旧试验溶液。流水式试验无需测定待更新试验溶液，应每天检查试验用水及贮备液的流速。5.8 数据处理在试验期间，若供试物浓度保持在配制浓度或初始浓度的20%范围内，应以配制浓度或初始浓度计算结果。若偏离此范围，则以实测浓度
12、计算结果。通过对供试物处理组繁殖的幼溞总数量进行与空白对照组的数据进行统计分析，以此来评估供试物对大型溞繁殖试验的影响。选择合适的统计方法或相关统计学软件计算EC及其95%置信限。6 质量控制（1）试验开始时所用幼雌溞溞龄不能超过24 h，且为非头胎溞。（2）为确保试验的有效性，对照组应符合以下要求：试验结束时，亲溞的死亡率不能超过20%；试验结束时，每只存活亲溞所产成活幼溞的平均值60只。附录A （资料性附录）Elendt M4培养液和M7培养基的制备使用去离子水、蒸馏水或反向渗透水分别制备各微量元素的贮备液，用贮备液制备贮备液，它含有的所有微量元素（混合液），见附表1。附表1 微量元素配制
13、表贮备液（单一物质）加入到水中的量（mg/L）浓度（与M4培养基的关系）为制备混合的贮备液把贮备液加入到水中的量（mg/L）M4M7H3BO35 719020 000倍1.00.25MnCl24H2O7 21020 000倍1.00.25LiClH2O6 12020 000倍1.00.25RbCl1 42020 000倍1.00.25SrCl26H2O3 04020 000倍1.00.25NaBr32020 000倍1.00.25Na2MOO42H2O1 26020 000倍1.00.25CuCl22H2O33520 000倍1.00.25ZnCl226020 000倍1.01.0CoCl26
14、H2O20020 000倍1.01.0KI6520 000倍1.01.0Na2SeO343.820 000倍1.01.0NH4VO311.520 000倍1.01.0Na2EDTA2H2O5 0002 000倍FeSO47H2O1 9912 000倍Fe-EDTA溶液1 000倍20.05.0注：Na2EDTA和FeSO4两者单独制备，倒在一起后立即灭菌。常量营养元素和维生素见附表2。附表2 营养元素和维生素加入到水中的量（mg/L）浓度（与M4培养基的关系）加入制备培养基中贮备液的量（mg/L）M4M7贮备液20倍5050（微量元素混合液）常量营养贮备液（单一物质）CaCl22H2O293 8001 000倍1.01.0MgSO47H2O246 6002 000倍0.50.5KCl58 00010 000倍0.10.1Na
