第4章：发酵工业培养基

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1、 工业发酵培养基 多 快 好 省 碳源 氮源 矿质养分 生长因子 水 前体 活性物质 固态发酵 液态发酵 半固态发酵 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 分批灭菌 连续灭菌 组成确定 5点注意事项 对底物的利用速率 C N 浓度 pH 原料 第4章 发酵工业培养基 4 1发酵工业培养基概述一 概念1 培养基提供微生物生长 繁殖及代谢需要的营养基质 2 发酵工业培养基 能用于工业生产的微生物培养基二 确定培养基组成的原则 有利于细胞快速繁殖 有利于积累大量的发酵产物 三 培养基的成分 配比对发酵的影响1 微生物生长 2 发酵产品的生物合成量 速度及提取的难易程度 3 产品的产量 质量 4 2发酵

2、生产的培养基类型根生产工艺的要求及用途可分为3类 一 斜面培养基1 作用 供菌种活化 保存 繁殖用 2 对斜面培养基的要求 使菌体生长快 繁殖快 健壮 不易引起菌种变异 3 组成特点 C N源物质 不宜过多 尤其是C源 多了易引起pH波动 无机盐浓度 亦要适当控制 以免引起菌种特性变化 二 种子培养基1 制备发酵 种子 发酵剂 的目的提高发酵罐的利用率 为了增加发酵罐的接种量 往往先将斜面菌种在种子罐中繁殖到一定数量 以缩短菌体在发酵罐内生长繁殖所需时间 缩短延滞期 提高发酵罐的设备利用率 2 发酵级数菌种从种子罐到发酵罐扩大的次数 二级发酵 1个种子罐 个发酵罐 三级发酵 个种子罐 个发酵罐

3、 在三级发酵中 将小种子罐 一级种子罐 的菌剂接入到较大的二级种子罐中培养 繁殖后再接入发酵罐中 3 设计发酵级数依据的3大原则 菌种的性质 孢子数 孢子发芽率及生长率 单位体积或重量的孢子浓度大 发芽快 生长快的菌种 发酵级数少 否则 级数多 发酵罐中种子的最低接种量 接种量少者 级数少 否则 级数多 多次繁殖才能得到足够的接种量 种子罐容积 V1 与发酵罐的容积 V2 比 容积差异或V2 V1比值愈大 级数愈多 4 对种子的3大要求 纯 无杂菌 壮 健壮 活力旺盛 繁殖快 多 有足够的数量 5 对种子培养基成分的要求 目的 菌种繁殖快 数量多 丰富 完全 特异 浓度适当 繁殖快 易被菌体吸

4、收利用 速效 尽量与发酵培养基接近 减少延滞期 宾至如归 C N控制合理 过大 产酸 pH稳定 非连动型产物之发酵 种子培养基不需添加形成产物所需前体等特殊物质 6 注意事项 种子扩大条件与发酵条件一致 种子培养基的主要成分和培养条件 应尽可能与发酵培养基及发酵条件一致 以减少菌种转入发酵罐后菌体为适应新环境而进行的酶诱导等生理适应 使菌种迅速转入旺盛生长繁殖 不考虑产物合成所需的特殊成分 对于非生长连动型产物的发酵 种子培养基不需要添加用于形成产物的前体等特殊物质 次生代谢产物形成所需的物质 以节约生产成本 只考虑细胞繁殖数量 不考虑产物合成 三 发酵培养基 用于发酵产品生产的培养基1 作用

5、 两大功能 提供菌体生长繁殖所需各种营养成分 提供发酵产品生物合成所需原料 2 要求 能满足细胞快速繁殖的需要 短时间得到大量细胞培养基成分适当丰富 完全 具特异性 因菌而异 适合于该菌种的生理特性 菌体生长 繁殖迅速 健壮 能在较短周期内得到大量的细胞数 含有目标代谢产物合成必需的前体 活性因子 培养基要适当丰富与完全 防止 大量速效养分抑制次级代谢产物合成 3 目的 两快 两多 菌体 生长快而健壮 细胞数量多 目的 代谢产物合成速度快 数量多 四 培养基类型的其他分法 一 按纯度划分1 合成培养基 生理研究 用化学试剂配 2 天然培养基 用植物 动物或微生物等天然有机材料或农副产品下脚料配

6、制 发酵工业最重要优点 不纯 营养丰富 适于微生物快速生长繁殖与目的产物合成 不需另加微量元素 维生素 来源广泛 价格低廉 缺点 组分复杂 不易重复 影响生产稳定性 二 按状态分1 固态 用途 菌种分离 保存 真菌子实体生产 真菌酶制剂生产 放线菌活菌制剂生产等2 半固态 琼脂 0 5 0 8 菌种鉴定 细菌 运动特征 观察 小曲酒生产 糖化 酒化并行 3 液体培养基 发酵工业最重要的培养基 O2与养分传递容易 4 2发酵培养基原料设计工业发酵培养基组成时 除了营养要求外 还要考虑 原料来源与生产成本工业培养基原料选择3原则 A 营养特性 营养丰富B 原料来源 来源广泛C 生产成本 价格低廉原

7、料类型 6种普通原料 碳源 氮源 矿质养分 生长因子 特殊原料 前体 活性因子 一 碳源及其主要功能 一 生理功能A 菌体生长 繁殖 提供碳源 能源B 目的产物合成 提供C架 能源 二 常用碳源 糖类 淀粉 油脂 有机酸 低碳醇等在碳源严重缺乏时 Pr水解物AA亦可作为C源 工业发酵所用天然C源 玉米粉 薯干粉 野生植物淀粉 纤维及半纤维素等 中亦含有大量AA 维生素和矿质养分 即C N 矿质养分同时存在 1 糖类A 葡萄糖 G 最易利用之糖 速效糖注意两点副作用 产酸 G过多 呼吸作用过强 耗氧量过大 溶解氧不能满足需要 培养体系处于厌氧发酵状态 中间产物不能通过呼吸作用完全氧化 积累在菌体

8、或培养基中 如丙酮酸 乳酸 乙酸等导致pH下降 影响酶活性 抑制微生物生长与产物合成 葡萄糖效应 抑制次级产物合成 G分解产物阻遏或抑制某些目的产物合成所必需的酶的形成与酶的活性 导致某些次级代谢产物 抗生素等 不能合成 B 糖蜜 糖厂生产糖时的结晶母液 副产物 含有丰富的糖 氮素化合物 矿质元素 维生素 是发酵工业价廉物美的原料 糖蜜主要含蔗糖 含糖量达50 70 W V 糖蜜分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种 成分不同 使用时要查阅有关资料 糖蜜常用于酶母的酒精发酵 丙酮丁酮生产及抗生素发酵 2 淀粉常用碳源 需水解为单糖后再利用 优点 克服G过多的两大缺点 代谢过快耗氧产酸 葡萄糖效应 来源丰富

9、 价格低 常用淀粉 玉米淀粉 小麦淀粉和甘薯淀粉 注意事项 培养基中淀粉含量大于22 0 时 易结块 应该先用淀粉酶糊化液化 然后再混合 配制 灭菌 含淀粉酶的微生物可直接利用玉米粉 甘薯粉 土豆粉 3 油与脂肪有的微生物含脂肪酶 油 脂肪 脂酶 甘油 脂肪酸 CO2 H2O ATP 油脂作C源时 应注意下列问题 氧化分解时的耗O2量远大于糖为C源时的需O2量 若O2不足 形成厌氧发酵条件 代谢形成的有机酸积累 pH下降 影响微生物酶系作用 脂肪酸降解形成的 短链C架 可直接参与目的产物合成 提高发酵产物产量 4 有机酸有机酸盐作C源时 随C架氧化 pH上升 原因 CH3COONa 2O2 2

10、CO2 H2O NaOH 不同C源在降解氧化时 对pH的影响不同 A G pH下降 供O2不足条件下 B 油 脂 pH下降 供O2不足条件下 C 有机酸盐 pH上升 Na OH NaOH5 正烷烃 C14 C18 可用于有机酸 AA 维生素 酶制剂生产 但因成本等原因 尚未应用 能源危机 不能用 在不同C源上 细胞得率不同 细胞产量各种C源的化学组分 可查阅有关手册 二 N源及主要功能Pr AA为主 其他为辅N 构成菌体细胞物质 AA Pr 核酸 含N目的产物 A 菌体生长 繁殖所需N素 细胞建造 B 合成 目的产物 所需N素 产物成分C 合成 目的产物 所需 前体 调节物 有机N源在工业发酵

11、培养基中十分重要 1 有机N源 饼粉类 黄豆饼粉 花生饼粉 棉籽饼粉 玉米浆 蛋白胨 酵母粉 鱼粉 蚕蛹粉等 有机氮源物的组分 7种 蛋白质 AA 糖类 脂肪 无机盐 微量元素 生长素等 是微生物的良好营养物质 微生物在有机N源培养基中生长旺盛 菌丝浓度增长迅速 原因 微生物能 直接利用 有机N源中的 AA 不同结构的C架 半成品 预制件 合成所需Pr及其它细胞物质 而无需从糖代谢开始合成各种细胞物质 坐享其成 产地 加工方法均影响饼粉的物质组成 低温压榨 40 50 中温压榨 80 90 高温压榨 100 溶媒浸出 玉米浆生产玉米淀粉 酒精发酵的副产物 其中固体含量达50 左右 还含有较多有

12、机酸 pH 4 0 良好N源 易被微生物利用 原因 含有丰富的AA 还原糖 有机酸 微量元素 生长素 其中的磷酸肌醇对促进红霉素 链霉素 青霉素 土霉素等合成有积极作用 玉米来源 加工方法不同 浆之化学成分不同 酵母膏 蛋白胨 鱼粉 蚕蛹粉 血粉 对不同微生物有不同的生物效应 影响 A 菌体形成 B 产物的数量与质量 实例 a 酵母膏 影响利福霉素合成能力 b 植物蛋白胨 提高 麦白霉素 生物合成量 c 玉米粉 含 柔红霉素 生物合成的诱导物 尿素 成分单一 无上述复杂有机N的作用 青霉素 谷氨酸发酵中常用 能使 酮戊二酸还原并氨基化 提高谷AA合成能力 AA 成本高 一般不作为N源用 2 无

13、机N源 速效N源 化学肥料 铵盐 硝酸铵 氨水 易发生类似 G效应 的现象 速效N快速利用 形成的 代谢产物 阻遏 抑制了参与抗生素合成的有关酶的合成 活性 抗生素产量大幅度下降 含氮生理酸碱性盐 引起pH变化A NH4 2SO4 NH4 利用 SO4 2 2H H2SO4 pH下降 生理酸性盐 B NaNO3 NO3 利用 Na OH NaOH pH上升 生理碱性盐 生理酸 碱性盐配合理使用 矫正pH 意义重大实例 A 用曲霉制糖化酶 加NaNO3 菌体粗壮 培养时间短 糖化力高 酶活性强 原因 曲霉产酸 Na NaOH矫正 pH稳定 B 黑曲霉发酵制纤维素酶 加 NH4 2SO4 NH4

14、利用 SO4过剩 H2SO4 pH下降抑制杂菌 糖化酶活力高 NH3 H2O许多抗生素发酵中通NH3 注意 A 加NH3时防止局部过碱 少量多次 加强搅拌 B 过滤除菌 因为氨水中含有大量耐碱微生物 引起污染 三 矿质养分略 CaCO3调pH 四 生长因子五 水质各地水质不一致 六 前体微生物合成目的产物必需的化学结构 该结构是目的产物分子结构的骨架或目的产物分子结构的一部分外源前体 菌体不合成 或 合成少 不够用 需外源加入的化学结构内源前体 菌体细胞自身合成的化学结构 1 外源前体产生菌不合成或合成极少 需由外源添加的 以供合成目的产物的化合物 培养基中需加入 实例 青霉素G V合成 苯乙

15、酸 苯氧乙酸 在青霉素发酵中 加玉米浆 青霉素产量提高5倍 原因 玉米浆中含苯乙酸等2 内源前体产生菌自身合成的 用于目的产物化学结构形成的化合物实例 氨基乙二酸 半胱AA 缬氨酸为青霉素 头孢霉素C合成的前体 目的产物 合成与否及产量高低 与 前体 密切相关 无前体 则目的产物合成如 无源之水 七 活性物质需要量少 但作用明显的化学物质 1 刺激剂与其功能 机理不清 但效果明显 实例 甲硫AA 亮AA 对头孢霉素C合成影响很大 荼乙酸 金霉素 巴比妥 链霉素2 抑制剂及功能 作用于酶 抑制一些途径 激活另一些途径 合成特定产物实例 亚硫酸氢钠 NaHSO3 抑制乙醇合成 促进甘油合成 青霉素

16、 影响细胞壁合成 通透性 提高谷AA产量 碱金属磷酸盐 抑制草酸形成 促进柠檬酸形成 3 诱导剂 次生代谢诱导 抗生素 A因子 链霉素 B因子 利福霉素 酶之诱导 诱导剂 诱导酶 Pr Pr酶 纤维素 纤维素酶 果胶 果胶酶 淀粉 淀粉酶 4 促进剂实例 生产红霉素 要加入正丙醇 生产核黄素 要加入丙酸盐 生产金霉素 灰黄霉素 要加入Cl元素等 青霉素G发酵时 加入玉米浆后产量从20 g ml增加到100 g ml 原因 玉米浆中含苯乙酸 胺 能被优先结合到青霉素分子中去 故可提高产量 生产青毒素G 加入苯乙酸 制备青毒素V 加入苯氧乙酸 注意 量多时有毒性 应流加 4 3发酵培养基原料预处理发酵工业所用原料以农副产品和工业有机下脚料为主 为适于各种微生物利用 常需进行预处理 主要原料的预处理方法如下 一 淀粉水解淀粉 短链糊精 双糖 单糖水解方法 酸法 酶法 酸酶结合法 1 酸解优点 水解速度快 应用普遍应用 AA发酵 核苷酸发酵均采用此法 工艺流程 淀粉 水 淀粉浆 18 22 调淀粉浆pH 1 5 水解 2 8 3 0kg cm2 15 30min 水解糖液 降温 中和 脱色 过