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1、重叠PCR OverlapPCR 的基本原理及其简单运用 刘梦鸽谢志能曹志秦朱建勋林福龙 2016 06 08 重叠延伸PCR技术 genesplicingbyoverlapextensionPCR 简称SOEPCR 由于采用具有互补末端的引物 使PCR产物形成了重叠链 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸 将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的一项技术 简介 特点 可简单迅速将两个DNA片段连在一起 用于嵌合体基因的构建 可以进行定点突变 可以在两基因片段间加入其他序列 酶切位点或者标签 丰富的PCR的扩增范围 尤其在获得长DNA片段方面 省去常规克隆的繁琐 2 运用 通过酶切法得到相应的粘性
2、末端 再利用连接酶得到 任务 两个基因片段 或者一个基因和启动子 终止子要连接在一起 常用的方法 1 没有合适的酶切位点2 酶昂贵 使用少 重叠PCR技术 迅速 经济 简单易行 4 不可行 几个主要的运用 大于10000bp的基因 基因A 基因B 基因A B 目的基因 CDS1 CDS2 CDS3 内含子 内含子 无内含子的编码序列 5 引物的设计 基因1 基因2 F1引物 R2引物 R1引物 F2引物 基因1 基因2 基因1 基因2 碱基相同区域 至少20bp 基因1 基因2 PCR怎么样发生反应 PCR扩增 PCR扩增 6 反应机理 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 3 3 5 5
3、3 3 加入酶 buffer等反应液 PCR仪中解链 退火 单链模板结合 F1引物 R1引物 F2引物 R2引物 无目标产物 5 5 3 3 加入F1引物 R2引物 5 5 3 3 F1引物 R2引物 大量扩增目的基因 基因A 基因B 7 在定点突变方面的应用 GC AAAGGCATCGACG TTTCCGTAGCT F1引物 F2引物 R1引物 R2引物 碱基同源区域 突变碱基 突变碱基 可以在引物上换成任何其他碱基 碱基同源区域 保证20bp左右 这样有利于OverlapPCR得到目标序列 GC AAACG TTT GC AAATGCATCGACG TTTACGTAGCT F1引物R1引物
4、 F2引物R2引物 GC AAATGCATCGACG TTTACGTAGCT OverlapPCR 得到突变后的目的基因 8 上述反应体系中 反应液的加入有两种不同的方式 一种是先加入酶 模板 基因A和B buffer dNTP 水 经过5个循环得到完整的目的基因 然后入引物 大量扩增目的基因 虽然这样操作繁琐 但是可以得到特异性扩增产物 另外一种是直接一步加入所有需要的反应液 虽然此操作简单省时 但是会出现非特异扩增条带 影响胶回收 产量也会减少 9 注意事项 1 两基因模板间的重叠部分不能少于20bp 否则退火时模板贴不紧 得不到融合的目的基因 2 四条引物的TM值尽量保持相同或一致 利于引物的灵活使用 3 控制重叠PCR的循环次数比一般PCR少 这样可以减少非特异性条带 4 控制PCR模板的浓度 已经融合模板的比例 一般控制摩尔浓度比为1 1 且质量在20ng左右 10 谢谢 11 OVER LAPPCR得到完整基因 5cycle 加入100 M浓度的F和R引物各0 5 l 12cycle 12 Maker 目的基因条带2154bp胶回收得浓度 40 g mL
