《分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验一植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测.ppt（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测 高级分子生物学实验课一 实验要求 分组实验仔细观察 认真操作不大声喧哗不迟到早退有事向课代表请假按时交实验报告 DNA结构 ATGC DNA存在形式 与蛋白质结合在一起以核蛋白 DNP 的形式存在 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来 细胞破碎研磨膜 组蛋白的分离CTABSDSDNA纯化蛋白变性去除酚 糖DNA的沉淀乙醇异丙醇 植物DNA提取流程 细胞破碎 机械方法 超声波处理法 研磨法 匀浆法 化学试剂法 用SDS处理细胞 酶解法 加入溶菌酶或蜗牛酶 破坏细胞壁 DNA提取 SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂 细胞中DNA与蛋白质之间
2、常借静电引力或配位键结合 SDS能够破坏这种价键 CTAB法CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子去污剂 可溶解细胞膜并与核酸形成复合物 该复合物在高盐的溶液中 0 7mol LNaCl 可溶 通过有机溶剂抽提 去除蛋白 多糖 酚类等杂质后 加入乙醇沉淀 CTAB能溶于乙醇 即可使核酸分离出来 Tris HCl pH8 0 提供一个缓冲环境 防止核酸被破坏 EDTA螯合Mg2 或Mn2 离子 抑制DNase活性 NaCl提供一个高盐环境 使DNP充分溶解 存在于液相中 CTAB溶解细胞膜 并结合核酸 使核酸便于分离 巯基
3、乙醇 PVP 是抗氧化剂 有效地防止酚氧化成醌 避免褐变 使酚容易去除 CTAB抽提液作用原理 DNA纯化 去杂质 蛋白质常用苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 或氯仿 异戊醇 24 1 抽提 RNA常选用RNase消化 或是用LiCl来消除大分子的RNA 酚类物质提取液中加少量巯基乙醇 选取幼嫩的材料 多糖提取液中加1 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 实验材料杨树叶片试剂2 CTAB抽提液氯仿 异戊醇 24 1 异丙醇70 乙醇 材料与试剂 微量移液器 水浴锅 离心机 电泳仪及电泳槽 凝胶成像仪 仪器用具 常见问题 常见问题 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 在一定电场
4、强度下 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比 电泳原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 Tris 乙酸 TAE Tris 硼酸 TBE Tris 磷酸 TPE 常用电泳缓冲液 维持合适的pH具有一定的导电性 以利于DNA分子的迁移保护DNA不被降解 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色 一般与蔗糖 甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液 作用 增加样品比重 以确保DNA均匀沉入加样孔内 形成肉眼可见的指示带 预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色 使加样操作更方便 上样缓冲液 核酸染色剂 溴化乙锭 EB 是一种荧光染料 EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光 其荧光强度与DNA的含量成正比 据此可粗略估计样品DNA浓度 注意事项 EB是致癌物质 切勿用手接触 更不要污染环境 其它染料 GeneFinder Goldview Genegreen等 DNA分子量标准 染色 照相 溴化乙啶 EB UVLightCCD 实验报告目的 材料与方法 结果 讨论 作业
