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1、杜金城141010896 利用16SrDNA进行细菌的鉴定 1 目录 02 03 文本目录 文本目录 16Sr 的定义及其应用于细菌鉴定的原因 04 01 鉴定存在的不足及其解决办法 鉴定的一般步骤 16SrDNA在细菌鉴定中的应用 2 16SrDNA的定义 16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基 16SrDNA就是编码该亚基的基因 用16SrDNA进行细菌鉴定的原因 在原核生物中普遍存在 的相对分子量大小适中 约 便于序列分析 在16SrRNA分子中 既含有高度保守的序列区域 又有中度保守和高度变化的序列区域 因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究 3 鉴定的一般步骤 细菌
2、基因组的提取 测序获得 序列 验证 产物扩增是否成功 特异引物扩增 序列 与数据库中已知细菌比较获得样品种属信息 选取近似菌种序列构建系统发育树 4 1 弃尽培养液 向培养皿中加入650 l的SolutionA 室温静置1分钟 2 用移液枪的取650 l的细胞悬浮液转移至CollectionTube中 3 加入0 8 l的RNaseA1 激烈振荡15秒钟 然后室温静置1分钟 4 弃去上层有机相 再加入1ml的4 预冷的SolutionC充分混匀后12 000rpm离心2分钟5 弃去上层有机相 然后将水相溶液转移至置于CollectionTube上的FilterCup中6 弃FilterCup
3、在滤液中加入400 l的DBBuffer 混合均匀 7 将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上 将上述操作6混合溶液转移至SpinColumn中 12 000rpm离心1分钟 弃滤液 8 将500 l的RinseA加入至SpinColumn中 12 000rpm离心30秒钟 弃滤液 9 将700 l的RinseB加入至SpinColumn中 12 000rpm离心30秒钟 弃滤液 10 重复操作步骤9 11 将SpinColumn安置于新的1 5ml的离心管上 在SpinColumn膜的中央处加入50 200 l的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer 室温静置1
4、分钟 12 12 000rpm离心1分钟洗脱DNA 5 特异引物扩增 DNA序列 这个过程一般先用PrimerPremier来设计引物 接下来在利用PCR进行特征序列的扩增 如果是乳酸菌可以用通用引物27f 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1495r 5 CTACGGCTACCTTGTTACGA 3 以下是我已EnterococcusKLDS6 0610的16SrDNA为例设计的引物 6 判断16Sr 序列扩增是否成功 经琼脂糖凝胶电泳在 附近出现条带 说明16srDNA已经扩增成功 由于16srDNA序列长度一般1500bp左右 7 测序获得 序列 这步一般由测序公司来完成
5、 以下是处理后得到的结果 GCATGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAG
6、GGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGA
7、TGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAA
8、GGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT
9、CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCTGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAGAGATGG 8 与数据库中已知细菌比较获得样品种
10、属的信息 将测序回来的结果处理后 导入NCBI进行BLAST比对 找到同源性比较高的细菌 9 1 选取序列时候要选模式菌株 16SrDNA序列 将下载序列导入到MEGA 构建系统发育树 确定种属信息 2 在导入序列时候应注意是正向匹配还是反向匹配 正向匹配之间导入序列即可 反向时候还得将序列倒置 10 11 12 上面的序列在构建进化树时就需要倒置 大家可以上下面的网站 进入之后选SMS2 进行序列转换 13 接下来把这些序列导入到MEGA5 2 以下是导入后的结果 14 15 16SrDNA进行细菌鉴定的不足 有的菌种由于种间差异小 单独依靠16SrDNA鉴定不能鉴定到种 16 解决办法 1
11、 针对16SrDNA存在的不足 要想对细菌鉴别到种一般需要生化试验加以补充 生化试验包括葡萄糖发酵产酸试验 明胶液化试验 硫化氢试验 吲哚试验 七叶苷水解试验 硝酸盐还原试验等 生化试验结果参照 伯杰氏系统细菌学手册 从而使对细菌达到种的鉴定 传统生化实验需要时间较长工作量较大 现已有API ATB MID等鉴定系统 由于同时进行多种生化实验 从而能达到对细菌进行快速的鉴定2 利用16S 23SrDNA间隔 IGS 序列同源性分析 IGS序列是一段较低保守的基因间区 相较于16SrDNA结构基因序列 IGS间隔序列体现出了更大的差异性 17 18 根据API生化实验结果 在参照API生化鉴定手册或者是API电脑分析软件 从而对未知细菌进行鉴定 鉴定乳酸菌的话可以用APILABPlus分析软件 19 16SrDNA在细菌鉴定中的应用 1 对未知样品进行快速种属分析 2 为生化鉴定提供指导信息 3 对于难以获得纯培养的细菌 如寄生菌等 使用16SrDNA鉴定是唯一可用的鉴定手段 20 16SrDNA在细菌鉴定中的具体的应用 21 22 23 24 谢谢 25 26
