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1、 本科生毕业设计（论文）( 2009届 )题 目：红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离 学 院： 化学与生命科学学院 专 业： 生物科学 学生姓名： 付文佳 学号： 05260204 指导教师： 杨 莉 职称： 副 教 授 合作导师： 职称： 完成时间： 2009 年 5 月 20 日 成 绩： 浙江师范大学本科毕业设计(论文)正文目 录摘要1英文摘要11 引言12 材料22.1 植物材料22.2 实验试剂22.3 主要仪器和设备23 方法33.1 总RNA提取33.1.1 常用试剂配制33.1.2 器具处理与准备33.1.3 提取RNA33.2 RNA的纯化43.3 RNA提取质量与含量
2、检测43.3.1 总RNA的电泳分析43.3.2 总RNA含量与纯度测定43.4 cDNA链合成53.4.1 cDNA一链的合成53.4.2 cDNA第二链合成53.5 基因的克隆及序列分析63.5.1 基因的克隆63.5.2 割胶回收63.5.3 T-载体连接64 结果与分析74.1 RNA电泳结果分析74.2 RNA紫外分光光度计测定结果分析74.3 纯化后RNA电泳结果分析84.4 合成cDNA电泳结果分析84.5 PSY基因的克隆94.6 序列性分析95 讨论12参考文献14致谢词16红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离化学与生命科学学院 生物科学专业 付文佳（05260204）指
3、导老师：杨莉（副教授）摘要：采用改良Bugos法提取红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚成熟果实果肉RNA，逆转录合成cDNA。根据NCBI网站公布的PSY基因全序列设计引物，采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，将扩增产物连接到pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5，并送公司测序。比较发现，红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉PSY基因全长均为1317 bp，编码439个氨基酸，序列比对结果显示两者PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，同源性最高达99 %。关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；PSY基因；基因分离；序列分析Isolating PSY Gene from Red-fleshed Sweet Pomelo
4、 and Its Parent Guanxi Sweet Pummelo FU Wen-jia Director: YANG Li (College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, 052 No.04)Abstract：The total RNA was extracted from the ripe fruit of Red-fleshed sweet pomelo and Guanxi sweet pomelo using improved Bugos RNA extraction method, the
5、n were synthesised cDNA by reverse transcriptase kit. At the same time, we designed primers for PSY gene sequences according to the information PSY gene sequences on NCBI, high-fidelity Taq polymerase were used for PCR amplification and cDNA as the template. Finally, the PCR products were connected
6、to pUCm-T vector, then sequenced and analyzed the sequences. Sequence analysis indicated that the cDNA fragment was 1317 bp, encoding a 439 amino acid protein and haved 99 % identity with those of other citrus in the highest level. The researching may be essential for the molecLar mechanism of PSY g
7、ene mutation.Key Words：red-fleshed sweet pomelo; guanxi sweet pummelo; PSY gene; gene isolationing; sequence analysis1 引言芽变是体细胞突变的一种，即突变发生在芽分生组织细胞中，当芽萌发长成枝条，表现出与原来植株不同的性状即为芽变，经突变的芽长成枝条经繁育可成为变异单株，是果树等多年生作物的一种特殊育种途径1。红肉蜜柚源自琯溪蜜柚芽变，是平和县小溪镇厝丘村果农林金山于1988年在自家果园发现的优良芽变株2。之后，由福建省农科院果树研究所及平和县农业局等组成课题组，进行新品种的选
8、育、保护和繁殖工作。经专家3年实地跟踪验证，认为该品种具备新颖性、特异性、一致性和稳定性，并于2006年正式通过了专家组的品种认定，正式命名红肉蜜柚3。经检测：红肉蜜柚的微量元素比野生型琯溪蜜柚含量更丰富，所含的黄酮类和类胡萝卜素共同具有抗癌作用，比其它柚类更具防心脏病，降血脂功效。红肉蜜柚也是目前国内外已选育出的红肉类型柚中果形最大，品质最优，成熟期早呈色最红、有益天然色素含量最高的品种，其开发前境较大。近年来，越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素代谢中间产物是维生素A的前体外，在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面也起着十分重要的作用4。因此类胡萝卜
9、素既是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，也是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标。了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径具有重要的意义。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合成酶57。在番茄和油菜等植物中，PSY被证实是类胡萝卜素生物合成的关键调节酶之一。因此，PSY基因是应用植物基因工程改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。此外，该基因在成熟叶片中的表达高于幼叶8。前人在温州蜜柑果实发育过程中的研究，已经明确在b-隐黄质的积累起关键作用的主要是位于类胡萝卜素生物合成途径上游的PSY基因，而非下游的BCH基因9。本实验拟分
10、离红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因全长，比较分析二者序列是否存在差异，以了解PSY基因在突变体中的具体功能，为解释红肉蜜柚发生变异的分子机制提供理论基础。2 材料2.1 植物材料成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实由福建省农科院提供。2.2 实验试剂试剂Tris-HCl，EDTA，SDS购自北京博大泰克生物有限公司，b-巯基乙醇，DEPC（焦碳酸二乙酯），Tris饱和酚，LiCl购自北京鼎国生物有限公司，内切酶、连接酶，pUCm-T，DNase I载体购自宝生物工程（大连）有限公司，高保真Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，逆转录酶购自Promega生物技术有限公司，实验中涉
11、及的引物由上海赛百盛生物有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。2.3 主要仪器和设备高速台式冷冻离心机，电泳仪，电热恒温水浴锅，PCR仪，烘箱等。3 方法3.1 总RNA提取3.1.1 常用试剂配制0.1 % DEPC溶液：在经高温烘烤4 h除RNA酶的试剂瓶中用ddH2O配制成0.1 % DEPC溶液，37 放置12 h以上，120 高压灭菌30 min；2 M NaCl：11.688 g NaCl溶于100 mL DEPC处理的ddH2O，120 高压灭菌30 min；0.5 M EDTA：9.306 g EDTA溶于50 mL DEPC ddH2O，用氢氧化钠固体调节pH至9.0，120
12、 高压灭菌30 min；12 M LiCl：144.98 g L iCl加热溶解于200 mL DEPC ddH2O，120 高压灭菌30min；0.1 M Tris-HCl：12.11 g Tris-HCl溶于灭菌过的 DEPC ddH2O，用浓HCl调节pH至9.0；3 M NaAc：12.3045 g NaAc溶于30 mL DEPC ddH2O，加冰乙酸调节pH至5.2，定容至50 mL，120 高压灭菌30 min。70 %乙醇：取30 mL的DEPC ddH2O至70 mL无水乙醇中（DEPC ddH2O需先高压灭菌处理）。3.1.2 器具处理与准备塑料制品（包括枪头、EP管等）：
13、用DEPC ddH2O浸泡枪头、EP管，37 放置过夜，121 高压灭菌30 min，65 烘干备用；玻璃制品：清洗干净，0.1 % DEPC ddH2O处理，65 烘烤4 h。研钵：清洗干净，用锡泊纸包裹，180 烘烤68 h。3.1.3 提取RNA参照徐昌杰等建立的适于柑橘果实RNA的改良Bugos方法提取成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA10, 11。取3.5 mL提取液（提取液配方为0.1 M Tris，0.2 M NaCl，15 mM EDTA，0.5 % SDS，1 % b-巯基乙醇，pH 9.0），加1 g果肉（液氮研磨），混匀，室温放置5 min，加入1.5 mL Tri
14、s饱和酚，混匀，室温放置3 min；加入0.7 mL氯仿，混匀，室温放置3 min；加入0.28 mL NaAc，混匀，冰上放置15 min，4 ，10000 rpm离心20 min；上清液转至新的离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提；上清液转至新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提；上清液移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，-70 沉淀20 min；沉淀用1 mL DEPC ddH2O溶解，加入1/4 V LiCl混匀，冰上放置2 h（如有不溶杂质，在加LiCl前要离心去除）；4 ，10000 rpm离心20 min，沉淀用1 mL DEPC ddH2O溶解，加入1/4 VLiCl混匀，冰上放置2 h以上；离心，沉淀用0.6 mL DEPC ddH2O溶解；加等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一次，上清液加入2 V无水乙醇，1/10 V NaAc，-70 沉淀20 min；离心，沉淀用70 %无水乙醇漂洗，室温晾干，最后视沉淀的量加入50100 L DEPC ddH2O溶解。3.2 RNA的纯化DNase I处理：将提取得到的红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA，加
