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1、 CraigMello 生于1960年 是被恐龙骨引入科学世界的 梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石 从那时起 他就迷上了远古时代 地球历史和人类生命的起源等问题 高中时代 梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面 AndrewFire 1959年出生在美国加利福尼亚州 本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学 仅用3年时间就拿到学位 与梅洛类似 他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣 并将其作为自己终身的学术追求 RNA干扰 RNAinterference RNAi 南通大学生命科学学院谭湘陵 一 RNA干扰的发现 94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象 此称为基因压制 quelling 9
2、0年代初 美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事 在对矮牵牛 petunias 进行的研究中有个奇怪的发现 将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后 导入矮脚牵牛中 试图加深花朵的紫颜色 结果没看到期待中的深紫色花朵 多数花成了花斑的甚至白的 也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达 反而使原有的色素基因也受到了抑制 Jorgensen将这种现象命名为共抑制 cosuppression 一 RNA干扰的发现 一 RNA干扰的发现 Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe
3、 B Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex 3RNA purplestaining C Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex 3antisenseRNA Theseembryos andtheparentanimals retainmex 3mRNA althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype D Late4 cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingto
4、mex 3 nomex 3RNAisdetected TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon overlapping Effectsofmex 3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4 cellstageembryos 一 RNA干扰的发现 2001年 RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象 Nature 2001 411 6836 494 498RNAi技术被
5、 Science 评为2001年度的十大科技进展之一 二 RNA干扰的机制 dsRNA 双链RNA 包含正义链和反义链Dicer 属于RNase 家族 是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA smallinterferingRNA RNAi的关键效应分子 21 23个nt大小的双链RNARISC RNA inducingsilencingcomplex 具有核酸内切 外切以及解旋酶活性RdRP RNA dependentRNApolymerases 依赖RNA的RNA聚合酶 是RNAi的调节因子 使RNAi可以在生物体内传递 预备知识 基因沉默 二 RNA干扰的机制 转录水平的基因沉默 Tr
6、anscriptionalGeneSilencing TGS 转录后水平的基因沉默 Post transcriptionalGeneSilencing PTGS TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默 对于部分植物来说 转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致 PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录 但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象 基因沉默 目前普遍认为 共抑制 基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制 都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA 抑制相应基因的表达 均属于PTGS 现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程
7、主要分为两步 二 RNA干扰的机制 第一步 起始阶段 是较长dsRNA在ATP参与下被RNase 样的特异核酸酶切割加工成21 23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA smallinterferingRNA siRNA siRNA的两条单链末端为5 磷酸和3 羟基 且3 端均有2 3个突出的核苷酸 果蝇中的RNase 样核酸酶称为Dicer Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域 Dicer的类似物相继在拟南芥 秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现 二 RNA干扰的机制 第二步 效应阶段 是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链 并由其中反义链指导形成RNA诱导的
8、沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA 并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA 最后可能再被核酸外切酶进一步降解 从而干扰基因表达 RNAi能高效特异的阻断基因的表达 在线虫 果蝇体内 RNAi能达到基因敲除的效果 RNAi的放大效应机制 二 RNA干扰的机制 siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA 而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶 RdRP 作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA 新合成的长链dsRNA同样可被RNase 样核酸酶切割 降
9、解而生成大量的次级siRNA 次级siRNA又可进入合成 切割的循环过程 进一步放大RNAi作用 这种合成 切割的循环过程称为随机降解性PCR randomdegradativePCR GiselaStorz Science 296 5571 1263 1265 2002 RNAi是转录后水平的基因沉默机制 RNAi具有很高的特异性 只有dsRNA才能诱导产生RNAi 只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰 注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解 RNAi抑制基因表达具有很高的效率 可达到缺失突变体表型的程度 而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表
10、达 这是通过催化放大的方式进行的 二 RNA干扰的机制 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征 二 RNA干扰的机制 RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1 但F2往往恢复为野生型 dsRNA不得短于21个碱基 大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰 而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡 RNAi作用迅速 mRNA快速降解 RNAi效应的依赖性 只有连续产生dsRNA才能产生长期效应 否则只产生短暂的沉默反应 RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征 三 RNA干扰的应用 1 基因功能研究 由于RNAi具有高度的序列专一
11、性和有效的干扰活力 可以特异地使特定基因沉默 获得功能丧失或降低突变 因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达 制作多种表型 而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段 产生类似基因敲除的效应 与传统的基因敲除技术相比 这一技术具有投入少 周期短 操作简单等优势 近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多 标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具 三 RNA干扰的应用 2 病毒性疾病的治疗 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞 这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA 激发RN
12、Ai使其抑制了HIV 1的coreceptor CCR5进入人体外周 淋巴细胞 而不影响另一种HIV 1主要的coreceptor CCR4 从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答 由此治疗HIV 1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加 艾滋病 三 RNA干扰的应用 2 病毒性疾病的治疗 Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体 pSUPERX siRNA和pSUPERcore siRNA 已转染含1 3XwtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X siRNA或core siRNA转染后 core蛋白水平分别降低了89 63
13、 转染X siRNA的细胞中HBsAg降低60 但转染core siRNA对HBsAg表达无明显影响 X siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物 而core siRNA仅沉默3 5kb 3 9kb的mRNA HBV 三 RNA干扰的应用 2 病毒性疾病的治疗 Randall等证明了针对HCVRNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍 将siRNA转染至已有HCV感染 复制的细胞 siRNA对98 以上可检测到HCV抗原 HCV复制活跃的细胞有抑制作用 siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性 Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制
14、 阻止相关蛋白表达的作用 HCV 三 RNA干扰的应用 2 病毒性疾病的治疗 RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等 siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫 用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强 在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征 severeacuterespiratorysyndrome SARS 的防治研究中 RNAi也受到了重视 siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制 病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断 这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗 其它病毒 三 RNA干扰的应用 3 肿瘤
15、治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因 癌相关基因或突变基因的过度表达 使这类基因保持在静默或休眠状态 从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤 1 RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因 2 RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达 3 RNAi可应用于抑制基因扩增 Li等在3个肝癌细胞系Hep3B HepG2 SNU449中对cyclinE的研究中发现 转染siRNA组48h后生长抑制均达到90 而对照组无作用 3天后凋亡率分别为16 44 和3l 而对照组仅为l 三 RNA干扰的应用 3 肿瘤治疗 Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员 可通过抑制caspase级链
16、反应下游的caspase3 caspase7发挥其抗凋亡作用 现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发展 并且还与化疗的耐药性相关 降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡 抑制肝癌细胞的生长 还可增强其对化疗的敏感性 从而提高肝癌治疗的整体疗效 CHENG等通过RNAi抑制肝癌细胞SMMC7721中survivin基因的表达 使细胞株中survivin基因表达几乎缺失 凋亡指数增加15 6 肝癌细胞生长被抑制 三 RNA干扰的应用 3 肿瘤治疗 MDR Muhidrugresistance 是肿瘤化疗失败的主要原因 形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过度表达 其中 MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用 Nieth等表明 特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达 从而显著降低肿瘤细胞的耐药性 PLK1基因在很多种癌症时都呈高度表达 当使用RNAi技术减少其表达后 所有癌细胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有显著降低 如MCF 7乳腺癌细胞的PLKlmRNA下降了7O 蛋白水平下降了90 而且细胞凋亡率提高了百分之几至50
