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1、 免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体 南京医科大学微生物学与免疫学系卢春 概述 1 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 1968和1972年WHO和国际免疫学会决定 将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白 2 抗体 antibody Ab B淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞 产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 这类免疫球蛋白称为抗体 3 Ig与Ab的区别和联系 Ig是化学结构上的概念 Ab是生物学功能上的概念 所有的Ab都属于Ig 并非所有的Ig都具有Ab的活性 免疫球蛋白的基本结构 1 Ig的组成 由4条肽链通过链间S S双硫键连接而成 其
2、中两条分子量较大的链称重链 Heavychain H链 两条分子量较小链的称轻链 Lightchain L链 2 H链 据氨基酸 aa 组成及序列的差异 抗原性 将H链分为5类 链 其分别对应于 IgA IgD IgE IgG IgM五类Ig 第一节免疫球蛋白的结构和功能 ImmunoglobulinStructure 3 L链 据aa组成及序列的差异将L链分为2型 型 为2 1 人 天然Ig单体中 两条重链是同类的 两条轻链是同型的 4 Ig的分区 1 可变区 在Ig近N端L链的1 2和H链的1 4 或1 5 范围内 因aa组成及序列变化较大 故称可变区 Variableregion V区
3、2 恒定区 在Ig近C端L链的1 2和H链的3 4 或4 5 范围内 因aa组成及序列变化相对稳定故称恒定区 Constantregion C区 ImmunoglobulinStructure 5 Ig的结构域又称功能区 Domain 1 VH VL 超变区 HVR1 2 3 互补性决定区 CDR1 CDR2 CDR3 又称Ig独特型决定簇 Idiotype 2 CH1 CL 是各类 亚类 型 亚型Ig遗传标记所在部位 3 IgG的CH2 补体C1q的结合位点 IgG借助CH2通过胎盘 发挥被动免疫作用 4 CH3 IgG的CH3与中性粒 巨噬细胞表面表达的Fc R结合 完成免疫调理作用 与N
4、K细胞表面表达的Fc RIII结合 完成ADCC作用 5 IgE的CH4 IgE的CH4与肥大和嗜碱性粒细胞表面表达的Fc R结合 完成I型超敏反应 6 绞链区 Hingeregion TY ImmunoglobulinStructure Fab Fragmentofantigen binding AgbindingValence 1SpecificitydeterminedbyVHandVL Fc Crystalizablefragment Effectorfunctions 6 Ig的水解片段 木瓜蛋白酶 F ab 2AgbindingValence 2pFc Noeffectorfunc
5、tions 6 Ig的水解片段 胃蛋白酶 7 Ig的其他成分 1 J链 joiningchain 由浆细胞合成 功能是将单体Ig分子连接为多聚体 如2个IgA单体形成二聚体 5个IgM单体是形成五聚体 7 Ig的其他成分 2 分泌片 secretorypiece SP 由黏膜上皮细胞合成和分泌 功能是保护分泌型IgA或的IgM铰链区免受蛋白酶的降解 五类Ig的特点 Ig的生物学活性 1 特异性结合抗原2 激活补体3 与细胞Fc受体结合发挥生物效应 1 免疫调理作用 2 ADCC 3 介导I型超敏反应 4 人IgG的Fc段与SPA结合4 选择性传递 Ab的生物学活性 第二节免疫球蛋白编码基因和抗
6、体的多样性 概述 人类B淋巴细胞存在三个编码Ig的基因库 即重链H基因库及轻链 基因库 它们分别位于第14 2及22号染色体上 一 胚系B细胞中Ig轻链基因的结构 由3个基因所编码 V基因 J基因编码可变区 C基因编码恒定区 即V J C 一 链基因结构 1 V V 基因节段有90个 呈簇状串联排列 V 1 V n n 90 其中含30个假基因 指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因 但它可通过突变 置换及重排形成新的功能性基因 为可变区的多样性提供后备基因 V 编码V区110aa中的1 96aa 2 L序列 每个V 前都有一个L序列 Leader 编码产物为前导肽 对轻链蛋白合成至关重要
7、 3 J 位于V 下游 也呈串联排列 含5个基因节段 编码V区110aa中的97 110aa 4 C 只含单个外显子 编码C区蛋白 二 链基因结构 1 V V 基因节段有60个 呈簇状串联排列 V 1 V n n 60 其中含30个假基因 2 L序列 每个V 前都有一个L序列 Leader 编码产物为前导肽 对轻链蛋白合成至关重要 3 J 1 C 1 J 2 C 2 J 7 C 7 C 1 C 7代表各个亚型 链的基因节段 其中含4个功能基因节段和3个假基因 二 胚系B细胞中Ig重链基因的结构 由四个基因所编码 V基因 D基因 J基因编码可变区 C基因编码恒定区 即V D J C 一 重链V区
8、基因 1 VH VH基因节段有95个 成簇状串联排列 VH1 VHn n 95 其中含45个假基因 每个VH前都有一个L序列 Leader 其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上 Ln VHn编码疏水前导肽和CDR1及CDR2 2 DH JH DH有23个节段 成簇状串联排列 JH有9个节段 其中6个功能基因和3个伪基因 DH JH编码CDR3 JH编码可变区的骨架部分 Frameworkregion 二 重链C区基因 1 CH CH基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的Ig在体内成熟的顺序相似 分别是C C C 3 C 1 C 1 C 2 C 4 C C 2 除C 以外 其他CH基因
9、节段都有一个转换区 Switchregion S区 其作用是控制Ig类型转换 2 控制膜结合或分泌型Ig的基因 每个CH基因节段后分别排列着S和M两基因 S即分泌型 M即膜结合型 如C S M C S M 三 B细胞分化过程中的基因重排 1 基因重排定义 在B细胞分化和发育过程中 一部分基因节段互相接近 重新排列 形成功能性的免疫球蛋白基因单位 此过程称基因重排 GeneRearrangement 功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录 经转录后的加工 再表达为免疫球蛋白 2 可变区的基因重排 1 重链可变区的基因重排 选择一个DH与一个JH节段连接 DH JH 再选择一个VH与DH JH相连 一
10、旦VH DH JH重排成功且得到功能性表达 其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排 此现象称为等位基因排除 其产物同时启动轻链可变区的基因重排 2 轻链可变区的基因重排 链基因优于 链基因重排 选择一个V 与一个J 节段连接V J 其产物就会发生等位基因排除 同时也会抑制 链基因重排 称为同型排除 当两条染色体上的 链基因重排都失败时 才会启动 链基因重排 两条染色体上的VH基因都是无产物重排 或 基因和 基因都是无产物重排 细胞凋亡 Apoptosis 3 可变区的基因重排12 23规律和重组酶的作用 可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列 RSS 控制 遵循12 23规律且与DNA
11、损伤修复系统有关 4 重链类型转换 每个CH C 除外 前都含一个S区 短的串联重复序列 S区与重链类型转换有关 在B细胞分化过程中 V D J的重排及其与C的连接是不依赖抗原刺激 重排的V D J与C 和C 连接 经转录加工 此时在B细胞表面表达mIgM和 或mIgD 成熟的B细胞在抗原刺激下 B细胞在分泌IgM和 或IgD的同时 V D J从与C 基因连接转换到与C 或C 或C 的连接 完成了类型转换 2 Ig的多样性 1 组合性连接 重链的V D J连接 95个V基因 23个D基因 9个J基因 轻链的V J C 90个V 基因 5个J 基因 一个C 基因 60个V 基因 7个J 基因和C
12、 基因 2 接合多样性 发生在D J V D J V J连接时 1 密码子错位 2 框架 ORF 移位 3 N 序列插入 3 体细胞突变 体细胞突变也可以产生Ig的多样性 3 重排过程 第三节基因工程抗体 GeneticEngineeringAntibody 概述 单克隆抗体 McAb 在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很大的作用 但以下几点限制了抗体的导向治疗 1 鼠源性McAb在人体内易诱导免疫应答 2 人的McAb制备甚为困难 一 嵌合抗体 ChimericAntibody 原理 保留鼠Ig可变区部分 将其恒定区用人Ig取代 方法 PCR克隆鼠可变区基因和人恒定区基因 将两基因连接 并插入原
13、核或真核表达载体中 并导入大肠杆菌或转染真核细胞 就可表达出嵌合抗体分子 优点 亲和力保持良好 缺点 含鼠Ig可变区的异源性 仍易诱导人免疫应答 原理 仅保留鼠Ig可变区CDR部分 将Ig其它区域都用人Ig取代 方法 CDR序列的获得通常采用PCR技术 优点 大大降低了鼠抗体的免疫原性 缺点 亲和力不佳 二 CDR移植抗体 CDRGraftingAntibody 又称重构抗体或改形抗体 ReshapedAntibody 原理 将鼠IgFv中的VH和VL两肽链用不同的连接物连接成一条多肽链 称为单链抗体 ScFv 将两个相同或不同特异性的ScFv连接在一个分子上 就获得了双价ScFv 方法 DNA重组技术 共价或非共价交连 优点 亲和力保持良好 可针对2个不同的抗原表位 缺点 容易解离或被组织酶解 三 单链抗体 ScFv 和双价ScFv 原理 将鼠IgFab基因片段与丝状噬菌体FUSE5载体连接 产物转化大肠杆菌 使Fab与噬菌体外壳蛋白基因III以融合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面 构建成噬菌体表面肽库 Phagepeptidelibrarydisplay 再用特异性抗原对该肽库进行筛选 获得具有高度抗原亲和力的Fab 最后进行体外重建 方法 DNA重组技术 ELISA 优点 亲和力保持良好 缺点 容易解离或被组织酶解 四 噬菌体肽库技术构建抗体片段 Thanks
