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1、聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 是指在DNA聚合酶催化下 以母链DNA为模板 以特定引物为延伸起点 通过变性 退火 延伸等步骤 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程 是一项DNA体外合成放大技术 能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 可用于基因分离克隆 序列分析 基因表达调控 基因多态性研究等许多方面 概念 目录 PCR技术简史PCR的原理PCR的反应五要素PCR的反应条件的选择PCR的应用 PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史 20世纪60年代末 70年代初人们致力
2、于研究基因的体外分离技术 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想 经过DNA变性 与合适的引物杂交 用DNA聚合酶延伸引物 并不断重复该过程便可克隆tRNA基因 PCR技术简史 PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起 DNA合成酵素最早于1955年发现 DNApolymeraseI 而较具有实验价值及可得性的KlenowfragmentofE Coli则是于70年代的初期由Dr H Klenow所发现 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素 因此不符合一连串的高温连锁反应所需 现今所使用的酵素 简称Taqpolymerase 则是于1976年从热泉Hotspring中的细菌
3、 ThermusAquaticus 分离出来的 它的特性就在于能耐高温 是一个很理想的酵素 但它被广泛运用则于80年代之后 PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制 DNArepairreplication 它是于1971年由Dr KjellKleppe提出 他发表第一个单纯且短暂性基因复制 类似PCR前两个周期反应 的实验 而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr KaryB Mullis发展出的 Dr Mullis当年服务于一家物科技研究公司 Perkin ElmerCetusCorporation 目前这家公司在PCR的相关仪器及原料上占有很大的巿场 Dr Mullis并于1985年与S
4、aiki等人正式表了第一篇相关的论文 此后 PCR的运用一日千里 相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背 在1989年 Science将PCR中的DNA合成酵素命名为当年的风云分子 Moleculeoftheyear 而PCR本身则列为年度的重要科学发明产物 当然 它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠 1985年美国PE Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 其原理类似于DNA的体内复制 只是在试管中给DNA的体外合成提供几种合适的条件 摸板DNA 寡核苷酸引物 DNA聚合酶 合适的缓冲体系 DNA变性 复性及延伸的温度与时间 PCR的
5、改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段 其缺点是 Klenow酶不耐高温 在DNA模板进行热变性时 会导致此酶钝化 每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期 给PCR技术操作程序添了不少困难 这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视 引物链延伸反应在37 下进行 容易发生模板和引物之间的碱基错配 其PCR产物特异性较差 合成的DNA片段不均一 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶
6、此酶具有以下特点 耐高温 在70 下反应2h后其残留活性大于原来的90 在93 下反应2h后其残留活性是原来的60 在95 下反应2h后其残留活性是原来的40 在热变性时不会被钝化 不必在每次扩增反应后再加新酶 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率 增加了扩增长度 2 0Kb 由于提高了扩增的特异性和效率 因而其灵敏性也大大提高 为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别 将此酶命名为TaqDNA多聚酶 TaqDNAPolymerase 此酶的发现使PCR广泛的被应用 类似于DNA的天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 1 变性
7、denaturation 高温使双链DNA解离形成单链 94 30s 2 退火 annealling 低温下 引物与模板DNA互补区结合 55 30s 3 延伸 extension 中温延伸 DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应 70 72 30 60s PCR技术的基本原理 PCR的三个反应步骤反复进行 使DNA扩增量呈指数上升 反应最终的DNA扩增量的计算 Y 1 X nY代表DNA片段扩增后的拷贝数 X表示平 Y 均每次的扩增效率 n代表循环次数 平均扩增效率的理论值为100 但在实际反应中平均效率达不到理论值 PCR的反应动力学 反应初期 靶序列DNA片段的增加呈指数形式
8、随着PCR产物的逐渐积累 被扩增的DNA片段不再呈指数增加 而进入线性增长期或静止期 即出现 停滞效应 这种效应称平台期 大多数情况下 平台期的到来是不可避免的 标准的PCR反应体系 10 扩增缓冲液10 l4种dNTP混合物各200 mol L引物10 100pmol模板DNA0 1 2 gTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L加双或三蒸水至100 l PCR反应五要素 1 引物 primer 2 酶 TaqDNApolymerase 3 dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 4 模板 template 5 Mg2 magnesium 1 引物 引物是PCR特异性反
9、应的关键 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上 只要知道任何一段模板DNA序列 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物 用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物长度 15 30bp 常用为20bp左右 引物扩增跨度 以200 500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb 引物碱基 G C含量以40 60 为宜 G C太少扩增效果不佳 G C过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布 避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补 特别是3 端的互补 否则会形成引物二聚体 产生非特异的扩增条带 引物3 端的碱基应严格要求配对 特别是最
10、末及倒数第二个碱基 以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点 这对酶切分析或分子克隆很有好处 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物设计的原则 目前有两种TaqDNA聚合酶供应 天然酶 从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶 大肠菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2 5U 指总反应体积为100 l时 浓度过高可引起非特异性扩增 浓度过低则合成产物量减少 2 酶及其浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状 保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性 使用时应小量分装 20 冰冻保存 多次冻
11、融会使dNTP降解在PCR反应中 dNTP应为50 200umol L 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等 等摩尔配制 如其中任何一种浓度不同于其它几种时 偏高或偏低 就会引起错配 浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP能与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度降低 3 dNTP的质量与浓度 4 模板 靶基因 targetgene 模板核酸的量与纯化程度 是PCR成败的关键环节之一 传统DNA纯化方法 采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本 SDS 是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 并解离细胞中的核蛋白 SDS还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K能水解消化蛋白质 特别是与DNA结
12、合的组蛋白 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份 用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 临床检测标本 可采用快速简便的方法溶解细胞 裂解病原体 消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离 直接用于PCR扩增 RNA模板提取 采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法 要防止RNase降解RNA 5 Mg2 浓度 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 Mg2 浓度过高 反应特异性降低 出现非特异扩增 浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性 使反应产物减少 在一般的PCR反应中 dNTP浓度为200 mol L时 Mg2 浓度为1 5 2 0mmol L为
13、宜 PCR反应条件的选择 温度 时间 循环次数 1 温度与时间的设置 变性 退火 延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法 双链DNA在90 95 变性 再迅速冷却至40 60 引物退火并结合到靶序列上 然后快速升温至70 75 在TaqDNA聚合酶的作用下 使引物链沿模板延伸二温度点法对于较短靶基因 长度为100 300bp时 将退火与延伸温度合二为一 一般采用94 变性 65 左右退火与延伸 变性温度与时间 变性温度低 解链不完全是导致PCR失败的最主要原因一般93 94 1min足以使模板DNA变性若低于93 则需延长时间但温度不能过高 因为高温环境对酶的活性有影响 此步若不能使靶基因模板
14、或PCR产物完全变性 就会导致PCR失败 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40 60 可使引物和模板发生结合 由于模板DNA比引物复杂得多 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成及其浓度 还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸 G C含量约50 的引物 55 为选择最适退火温度的起点较为理想 退火 复性 温度与时间 复性温度 Tm值 解链温度 5 10 在Tm值允许范围内 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合 提高PCR反应的特异性复性时间一般为30 60sec 足以使引物与模板之间完全
15、结合 引物的复性温度 延伸温度 一般选择在70 75 之间常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合 高于90 时 DNA合成几乎不能进行延伸反应时间 根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段 延伸时间1min 足够 3 4kb的靶序列需3 4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增 延伸时间要稍长些 延伸温度与时间 2 循环次数 决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 选在30 40次之间 循环次数越多 非特异性产物的量亦随之增多 PCR反应特点 特异性强灵敏度高简便 快速对标本的纯度要求低 1 特异性强 关键 引物与模板的
16、正确结合引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性 使反应中模板与引物的结合 复性 可以在较高的温度下进行 结合的特异性大大增加 被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度 再通过选择特异性和保守性高的靶基因区 其特异性程度就更高 2 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的 能将皮克 pg 10 12 量级的起始待测模板扩增到微克 ug 10 6 水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞在病毒的检测中 PCR的灵敏度可达3个RFU 空斑形成单位 细菌检测的最小检出率为3个细菌 3 简便 快速 PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶 一次性地将反应液加好后 进行变性 退火 延伸反应 一般在2 4小时完成扩增反应 扩增产物一般用电泳分析 不一定要用同位素 无放射性污染 易推广 4 对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞 DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板可直接用临床标本如血液 体腔液 洗嗽液 毛发 细胞 活组织等粗制的DNA扩增检测 研究基因克隆 DNA测序 分析突变诊断细菌 病毒 寄生虫检测 诊断人类基因组工程遗传图谱
